¿Cómo afecta la adición de probióticos en la dieta a la protección del epitelio intestinal en cerdos?

Aquellos animales que no tienen ningún mecanismo que favorezca la protección del epitelio intestinal, como la adición de probióticos en la dieta, son animales que no cuentan con ningún tipo de barrera que pueda proteger al epitelio intestinal contra la digestión enzimática6 , y a su vez a la presencia de agentes patógenos, como lo reporto Liu et al. 13, donde la presencia de rotavirus desarrollaba los signos de la enfermedad (diarrea) y cambios patológicos intestinales que limitaban la gastroenteritis, debido probablemente, a la ausencia del efecto protector que ejercía la mucina, mientras que aquellos animales que consumieron cepas probióticas estimularon la producción de mucina, reduciendo así el daño en el epitelio del íleon.

Probióticos en la dieta de lechones destetados

Q: ¿Qué implicaciones tiene la disminución de células caliciformes en la protección de la mucosa intestinal en cerdos?

una disminución de las células caliciformes, encargadas de secretar las diferentes mucinas intestinales, podría tener implicaciones negativas respecto a la protección de la mucosa, promoviendo posteriormente lesiones en el epitelio intestinal e infecciones entéricas14.

Q: ¿Qué efecto tienen los probióticos en la producción de mucina y en la protección del epitelio intestinal en cerdos?

aquellas animales que consumieron cepas probióticas estimularon la producción de mucina, reduciendo así el daño en el epitelio del íleon

Introducción

En la industria porcina, el destete no solo se constituye en una etapa crítica, sino además en el momento crucial sobre el crecimiento postnatal y el metabolismo de nutrientes en los lechones ²⁷. Este periodo se caracteriza por la reducción de la actividad metabólica, disminución de la absorción de nutrientes y aumento en la susceptibilidad a enfermedades entéricas ocasionadas por E. coli Enterotoxigénica (ETEC), salmonella spp, clostridium perfringes y rotavirus⁸ como consecuencia de la separación abrupta de la cerda antes de unirse a otras camadas en un ambiente diferente. Debido a esto, en el periodo de transición se da un cambio alimenticio de sustrato líquido (leche) a alimento sólido lo que ocasiona un aumento de estrés en los lechones ⁴ , provocando cambios desfavorables en la fisiología del intestino y así mismo en la mucosa del mismo^1,3.

La arquitectura del epitelio de la mucosa intestinal tiene varias barreras que tratan de evitar o impedir la infección por bacterias patógenas. Los mecanismos de protección, son empleados por todas estas barreras con el fin de mantener la integridad de la monocapa de células epiteliales y limitar el daño asociado con la inflamación¹⁸. El moco es una de las principales líneas de defensa del cuerpo contra los patógenos, toxinas y partículas extrañas, al mismo tiempo que lubrica y reduce la fricción. El moco está constituido principalmente por agua (95%), colesterol, lípidos, inmunoglobulinas, sales, proteínas y mucinas, siendo estas últimas, mucinas unidas a la membrana y mucinas secretadas ⁹ .

Las mucinas son glicoproteínas epiteliales involucradas en la protección de la integridad de la mucosa a través de la preservación de la función de la barrera epitelial, consideradas como los principales componentes estructurales del sistema de transporte mucociliar, atrapando a los patógenos en un capa de gel de mucina ¹¹. Estas mucinas son secretadas por las células caliciformes que permite al hospedero inhibir el acceso de patógenos a la mucosa subyacente^5,10 y que bioquímicamente pueden clasificarse en mucinas neutras y ácidas (sulfatadas y no sulfatadas), cuyas proporciones pueden variar dependiendo de diversos factores ambientales y clínicos (enfermedades de tipo entérico) ²⁴.

Diversos estudios de investigación se han centrado en las interacciones de los factores de la dieta con la actividad secretora de las células caliciformes¹², por lo que el objetivo de estudio fue determinar el efecto de la adición de diferentes cepas probióticas (L. casei, L. acidophilus o E. faecium) sobre la producción de mucinas intestinales en cerdos en etapa de crecimiento.

Materiales y métodos

Consideraciones éticas
Todos los procedimientos experimentales fueron llevados a cabo de acuerdo a las guías propuestas por “The International Guiding Principles for Biomedical Research Involving Animals” 7 . Esta investigación fue avalada por El Comité de Ética en la Experimentación Animal de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín (CEMED-03 del 07 de mayo del 2012).

Localización
El trabajo de campo se realizó en el Centro San Pablo, perteneciente a la Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, ubicado en el municipio de Rionegro, paraje “El Tablacito”, localizado a 2100 msnm, con una temperatura entre 12 y 18 ºC, correspondiendo a una zona de vida bosque muy húmedo Montano Bajo (bmh-MB).

Animales
Se utilizaron 35 lechones (hembras y machos) del cruce duroc x pietrain, destetados exactamente a los 21 días de edad, con un peso aproximado de 6 ± 0,5 kg, los cuales fueron alojados en grupos de 8 animales durante el período de levante. Cada una de las instalaciones o corrales estaba provista de comederos de canoa y agua a voluntad, se tenía temperatura controlada (26 ± 3 °C) por termometro digital. La dieta comercial ofrecida a los animales tuvo como componente leche y algunos de sus derivados, además, fue enriquecida con vitaminas, minerales y lisina HCL. Las dietas se balancearon para cumplir con todos los mínimos nutricionales requeridos y propuestos por el NRC 17 (Tabla 1). La cantidad de alimento ofrecido a los lechones por corral fue administrada de acuerdo a la tabla dietaría que corresponde para la etapa productiva (levante). Así mismo, el agua de bebida que contenía las cepas probióticas se ofreció diariamente desde el día 1 del destete hasta el sacrificio, el cual se realizó de manera secuencial o escalonada durante los primeros 30 días de la fase de levante. Durante la lactancia no se suministró alimento sólido a los lechones.

Tabla 1. Análisis Proximal de la dieta basal.

La adición de cepas probióticas modula la secreción de mucinas intestinales en íleon de cerdos en crecimiento - Image 1

Dietas

Los animales fueron alimentados con dos dietas: dieta comercial con y sin la adición de antibiótico. Los diferentes probióticos (L. casei, L. acidophilus o E. faecium) se suministraron en el agua de bebida de los animales que consumieron la dieta comercial sin antibiótico (Tabla 2).

Tabla 2. Dietas experimentales suministradas a los lechones en estudio.

La adición de cepas probióticas modula la secreción de mucinas intestinales en íleon de cerdos en crecimiento - Image 2

La cantidad del probiótico adicionado (relación v/p) fue del 20% con respecto al peso de la ración utilizada, siguiendo las instrucciones para su preparación y adición según lo recomendado por el fabricante. La inclusión de los probióticos en el agua de bebida se realizó por mezclado directo de un litro de agua con 30 gramos de azúcar comercial para garantizar poblaciones mínimas de 108 UFC con una viabilidad adecuada; luego este litro fue adicionado a un tanque de 50 lts y evaluado por medio de análisis microbiológicos semanales. El alimento utilizado en este estudio estuvo libre de antibióticos (excepto la dieta D2), ya que no fue de interés modificar la dieta, sino la incorporación de los probióticos como una alternativa al uso de antibióticos. Las dietas experimentales se proporcionaron durante 30 días a partir del día del destete (día 21 de vida).

Toma de muestras de tejido intestinal
Durante la fase experimental se realizaron eutanasias humanitarias a 35 lechones de la siguiente forma: el día inicial, o día 1 (día del destete), se sacrificaron 5 animales, que representaron el grupo de referencia para verificar el estado general de salud y la evaluación macroscópica del estado de los órganos de los animales antes de suministrar las dietas, y las unidades experimentales para cada uno de los tratamientos. Los días 15 y 30 posdestete fueron sacrificados 3 lechones de cada tratamiento. Estos, se sedaron con un neuroléptico stresnil® (Azaperona) vía intramuscular, posteriormente se sometieron a inhalación con Nitrox® y se sacrificaron 2.5 horas después de su última comida.

Después del sacrificio, los lechones se pusieron en posición decúbito dorsal, se diseccionó la región abdominal y se extrajo completamente el intestino delgado desde la unión pilórica hasta la válvula íleo-cecal²². La longitud intestinal se midió separando manualmente el tejido conectivo. En este experimento, el duodeno se tomó a partir del píloro hasta terminar el ángulo de treitz; el yeyuno fue el segmento proximal del intestino delgado restante; y el íleon fue el segmento proximal (10 cm) antes de la unión ileocecal. Aproximadamente 1 cm de las secciones transversales de tejido intestinal se eliminaron y se tomaron 5 cm desde el comienzo de cada uno de los segmentos: duodeno, yeyuno e íleon para cada animal. Una vez cortadas las porciones, la digesta contenida en cada una de ellas se removió mediante lavado por infusión con solución salina fría según lo descrito previamente^16,20, y se fijó únicamente la sección ileal en formalina al 10% para su posterior análisis en el laboratorio.

Análisis morfométricos del intestino delgado
Procesamiento histotécnico. Transcurrido 48 horas después de la colecta, las muestras de las diferentes secciones del intestino almacenadas en formalina al 10% 4 , fueron enviadas al laboratorio de Histopatología Animal de la Universidad de Antioquia (Facultad de Ciencias Agrarias) para su analisis respectivo.

Los tejidos ileales recolectados se sometieron a un metodo histotécnico con inclusión en parafina y se cortaron a 4µm de espesor. Luego se montaron 3 placas para someter los tejidos a tinciones histoquímicas e identificar así, los diferentes tipos de mucinas según las técnicas descritas por el Instituto de patología de las Fuerzas Armadas de los EEUU (AFIP) ¹⁹:

Coloración Azul alcián pH 1.0: para mucinas ácidas intensamente sulfatadas.
Coloración Azul de alcián pH 2.5: para identificar mucinas ácidas no sulfatadas.
Coloración de PAS (Periodic Acid Schiff): para identificar mucinas neutras.

Evaluación microscópica y análisis morfométricos de imágenes
Para evaluación cuantitativa de los cortes histológicos, se empleó un microscopio óptico Leica DMLB (Meyer Instruments, Houston,TX, USA), para la identificación de las zonas tisulares, luego con la cámara de microscopia digital instantánea Leica EC3 (Leica microsystems, Heerbrugg, Switzerland) con resolución de tres megapíxeles, en aumentos de 200x, se capturaron las imágenes de la mucosa; posteriormente, dichas imágenes se analizaron con el programa para tratamiento de imágenes ZEN (blue edition, Carl Zeiss, 2011), identificando un área circular de medida con un diámetro de 200µm y se realizaron seis mediciones por pliegue circular de la mucosa en varias zonas, así: dos en el vértice, dos en cada lado y dos en el fondo; para cada zona, la primera medición en la porción de la vellosidad y la segunda en la glándula de la mucosa intestinal con el fin de valorar su distribución. Finalmente, se realizó un conteo semiautomático de las células caliciformes positivas a cada una de las tinciones²⁸.

Diseño estadístico
El experimento se realizó según un diseño bloques al azar en un arreglo de parcelas divididas. Para la conformación de los bloques se tomó en consideración el peso inicial de los animales. A cada animal le fue asignado uno de los 15 tratamientos: 5 dietas (alimento sin adición de probióticos ni antibióticos, con adición de antibióticos sin probióticos; y con adición de L. casei, L. acidophilus o Enterococcus faecium) y tres periodos de medición. Cada tratamiento tuvo un total de 3 repeticiones. El análisis estadístico se realizó según el procedimiento GLM (Modelos Lineales Generales) del SAS21. Las diferencias entre las medias de los tratamientos fueron determinadas por mínimos cuadrados y analizadas por ANOVA. Para realizar la comparación de los promedios entre tratamientos se utilizó una prueba de Duncan (P< 0,05).

Resultados

Los cerdos que consumieron las dietas experimentales, en general, no presentaron ningún signo de enfermedad que causara su retiro del experimento o su sacrificio inmediato. Así mismo, el nivel en el cual se ofreció el suministro diario de alimento y agua no generó sobrantes en ningún momento del periodo experimental.

En este experimento no se encontró interacción estadística entre las diferentes dietas experimentales dentro de cada período de evaluación para ninguna de las variables en estudio, por lo que no fue necesario analizar y desglosar dichos factores de manera independiente.

Los cambios intestinales de las poblaciones de mucinas estudiadas en vellosidades y criptas (Lieberkühn) entre cada una de las dietas y periodos de exposición, se pueden observar en la tabla 3. Se presentó un aumento estadístico significativo (P< 0,01) para cada una de las mucinas entre la diferentes dietas evaluadas dentro de cada período de evaluación, donde D1 obtuvo valores menores respecto a D2 y frente a las dietas con probióticos, donde los animales en D5 reportaron los valores mayores tanto a nivel de vellosidades como de criptas.

Para las mismas variables en estudio, se presentaron diferencias significativas estadísticas entre los diferentes días de muestreo dentro de cada una de las dietas (P< 0,05), donde en el día 30 se presentaron los mayores valores para cada dieta en estudio.

En las figuras 1, 2, 3, 4, 5 y 6 se puede observar la expresión de MAS, MANS y MN respectivamente, en vellosidades y criptas de cerdos que consumieron dietas con y sin la adición de cepa probiótica por 30 días posdestete. Se puede observar que aquellos animales que consumieron D1 presentaron los valores más bajos respecto a D2, pero estos últimos no igualaron los valores registrados por las dietas que tenían adición de probióticos, donde los animales en D5 registraron los valores más altos de MANS.

Discusión

La mucina actúa como una barrera entre el lumen y el epitelio, protegiendo la superficie epitelial del intestino delgado de enzimas digestivas y de la abrasión debido a partículas de alimento y patógenos. La integridad de las uniones estrechas y las proteínas de la membrana plasmática extracelular, dependen de la estrategia de protección que proporciona las mucinas6 . Sin embargo, estas superficies mucosas son colonizadas por un gran número de especies bacterianas que crean una relación simbiótica con la mucina y ejercen una influencia importante en el desarrollo, la inmunidad y la nutrición²⁶.

Según los datos generados en este trabajo, los animales que consumieron las dietas con adición de probióticos (D3, D4 y D5, Bacterias acido lácticas) favorecieron la producción de mucinas en vellosidades y criptas de íleon, coincidiendo con los datos reportados por Wang et al. ²⁵, quienes a partir de células colónicas en ratones adicionadas con Lactobacillus rhamnosus GG inhibieron la adherencia de Escherichia coli enteropatógena a las células epiteliales intestinales a través de la producción de mucinas, demostrado que la expresión de genes Muc2 en las células epiteliales es inducida por el probiótico, lo que favorece la producción de mucina.

Tabla 3. Cambios en la secreción de mucinas acidas y neutras entre vellosidades y criptas en íleon de cerdos que consumieron las diferentes dietas durante 30 días posdestete.

La adición de cepas probióticas modula la secreción de mucinas intestinales en íleon de cerdos en crecimiento - Image 3

^{D1: Alimento comercial sin antibiótico y sin probiótico; D2: Alimento comercial + antibiótico; D3: Alimento comercial sin antibiótico + L. acidophilus; D4: Alimento comercial sin antibiótico + L. casei; D5: Alimento comercial sin antibiótico + E. Faecium. MAS: Mucinas Ácidas Sulfatadas. MANS: Mucinas Ácidas no Sulfatadas. MN: Mucinas Neutras. .A,B,C,D,E Dentro de una misma fila, medias con diferente superíndice son estadísticamente diferentes (P < 0.05).X,Y,Z Dentro de una misma columna, medias con un superíndice común (por variable en estudio) no difieren estadísticamente (P < 0.05). EEM: Error estándar de la media.}

La adición de cepas probióticas modula la secreción de mucinas intestinales en íleon de cerdos en crecimiento - Image 4

Figura 1. MAS en vellosidades en íleon de cerdos, con y sin adición de cepa probiótica durante 30 días posdestete.

La adición de cepas probióticas modula la secreción de mucinas intestinales en íleon de cerdos en crecimiento - Image 5

Figura 2. MAS en criptas en íleon de cerdos, con y sin adición de cepa probiótica durante 30 días posdestete.

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Figura 3. MANS en vellosidades en íleon de cerdos, con y sin adición de cepa probiótica durante 30 días posdestete.

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Figura 4. MANS en criptas en íleon de cerdos, con y sin adición de cepa probiótica durante 30 días posdestete.

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Figura 5. MN en vellosidades en íleon de cerdos, con y sin adición de cepa probiótica durante 30 días posdestete.

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Figura 6. MN en criptas en íleon de cerdos, con y sin adición de cepa probiótica durante 30 días posdestete.

Diversos estudios han reportado información sobre la presencia de mucinas acidas sulfatadas y no sulfatadas, las cuales podrían constituirse como una estrategia de protección frente a enfermedades entéricas en cerdos^2,23, así mismo, una disminución de las células caliciformes, encargadas de secretar las diferentes mucinas intestinales, podría tener implicaciones negativas respecto a la protección de la mucosa, promoviendo posteriormente lesiones en el epitelio intestinal e infecciones entéricas¹⁴.

Por tanto, aquellos animales que no tienen ningún mecanismo que favorezca la protección del epitelio intestinal, como la adición de probióticos en la dieta, son animales que no cuentan con ningún tipo de barrera que pueda proteger al epitelio intestinal contra la digestión enzimática6 , y a su vez a la presencia de agentes patógenos, como lo reporto Liu et al. ¹³, donde la presencia de rotavirus desarrollaba los signos de la enfermedad (diarrea) y cambios patológicos intestinales que limitaban la gastroenteritis, debido probablemente, a la ausencia del efecto protector que ejercía la mucina, mientras que aquellos animales que consumieron cepas probióticas estimularon la producción de mucina, reduciendo así el daño en el epitelio del íleon.

Lukic et al. ¹⁵, reportaron los beneficios que brindaba las bacterias ácido lácticas, ya que no solo favorecen la producción de mucinas a nivel intestinal, sino que además, promovían la expresión de proteínas de unión a mucina (MucBP), la cual inhibe a su vez, la adherencia de bacterias patógenas a la mucosa intestinal. Por tanto, aquellos animales que consumieron D3, D4 y D5 aparte de favorecer la expresión de mucinas, también podría promover la salud intestinal al evitar la colonización de patógenos en el epitelio intestinal.

La capa de moco formada por la mucina presente en el tracto gastrointestinal, se constituye como la primera barrera física contra patógenos, inhibiendo su adhesión y posteriormente su colonización. La producción de mucina es de vital importancia en la etapa de crecimiento de los lechones para minimizar la presencia de enfermedades entéricas que conlleva a grandes pérdidas en el sector porcícola.

E. faecium es un probiótico que al ser adicionado en la dieta de lechones destetados promueve la producción y secreción de mucinas, lo que podría verse reflejado en la salud intestinal de los mismos y a su vez, en los parámetros clínicos, sanitarios y productivos de los animales. Estos hallazgos respaldan la necesidad de realizar futuras investigaciones, que permitan comprender los mecanismos involucrados que regulan la secreción de las mucinas intestinales. Este conocimiento podría ayudar a diseñar estrategias de prevención y control de las enfermedades asociadas con este periodo crítico de la producción porcina.

Ciro Galeano, Johana Andrea; López Herrera, Albeiro; Parra Suescún, Jaime. Adding probiotic strains modulates intestinal mucin secretion in growing pigs ileum. Revista CES Medicina Veterinaria y Zootecnia, vol. 10, núm. 2, julio-diciembre, 2015, pp. 150-159
Universidad CES. Medellín, Colombia. Publicado en engormix.com por gentileza de los autores

Probióticos en la dieta de lechones destetados

La adición de cepas probióticas modula la secreción de mucinas intestinales en íleon de cerdos en crecimiento

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