Evaluación preliminar del efecto de la administración del antihelmíntico ricobendazol en el microbioma de heces de bovinos mediante la secuenciación del gen ribosomal 16S ARN

La interacción entre parásitos y la comunidad bacteriana (microbioma) en el tracto gastrointestinal de bovinos es perturbada por los tratamientos antihelmínticos (Daniels et al., 2020). El objetivo del trabajo fue utilizar la técnica de secuenciación parcial del gen 16S rARN para estudiar el efecto de la exposición a ricobendazol en el microbioma de heces de novillos con niveles contrastantes de conteos de huevos de nematodos gastrointestinales por gramo de materia fecal (hpg). La hipótesis fue que la exposición a ricobendazol produce alteraciones significativas en la composición y funcionalidad del microbioma, independientemente del nivel de hpg.

El trabajo se realizó en INIA Treinta y Tres (Uruguay), y consistió en evaluar los cambios en el microbioma fecal de 10 novillos (249±19 kg) con baja (< 100 hpg, n=5) y alta (840±207 hpg, n=5) carga parasitaria tratados con una dosis única de 3,75 mg/kg de ricobendazol (RICOVERM 15 g, König, Argentina) de acuerdo con la posología indicada en el producto.

Se tomaron muestras fecales del recto de cada animal pre-tratamiento (PRE-T) en el día 0, y post-tratamiento (POST-T) a los 3 y 10 días (T3 y T10, respectivamente). Se extrajo el ADN de cada muestra (QIAmp DNA Mini kit, QIAGEN) y se envió a Macrogen (Seúl, Corea del Sur) para amplificar y secuenciar la región V3-V4 del gen 16S rARN en una plataforma MiSeq (Illumina, San Diego, USA).

Las secuencias fueron asignadas taxonómicamente utilizando la base de datos SILVA (Quast et al., 2013) mediante el programa DADA2 (Callahan et al., 2016). Los contrastes estadísticos (P < 0,05) fueron realizados entre los grupos bajo y alto hpg, y entre las 3 fechas de muestreo (0, 3, y 10 días) siendo el animal la unidad experimental. Diferencias en diversidad alfa (índice Chao1) y beta (distancias UniFrac) fueron evaluadas utilizando el paquete Phyloseq (McMurdie and Holmes, 2013). La abundancia diferencial de géneros fue identificada mediante el paquete DESeq2 (Love et al., 2014) y la funcionalidad del microbioma fue predicha por PICRUSt2 (Douglas et al., 2020).

El tratamiento con ricobendazol redujo los conteos de huevos por debajo de 100 hpg en todos los animales posttratamiento. La riqueza de variantes microbianas (diversidad alfa) fue superior (P < 0,05) POST-T10 (870±40) comparado con PRE-T (791±58). El análisis de componentes principales (diversidad beta) demostró diferencias (P < 0,05) entre los microbiomas PRE-T y post-tratamiento (POST-T) (Figura 1). Los tratamientos POST-T3 y POST-T10 (P < 0,10) tendieron a presentar microbiomas diferentes, sugiriendo cambios al menos hasta 10 días luego de la administración de ricobendazol. La riqueza y diversidad de los microbiomas no fueron afectados (P > 0,05) por el nivel de hpg PRE-T.

Se identificaron 165 géneros bacterianos, 20 de los cuales (12%) fueron diferentes (P < 0,05) comparando el microbioma PRE-T y POST-T. Considerando los géneros más abundantes, Alistipes y Ruminococcaceae UCG-010 fueron enriquecidos POST-T; mientras que Christensenellaceae RC7, y Ruminococcaceae UCG-013 y UCG-014 fueron menos abundantes POST-T.

Figura 1. Análisis de componentes principales para evaluar la similitud de los microbiomas según día del muestreo en base a distancias UniFrac ponderadas. PRE-T: pre-tratamiento (8 ml RICOVERM 15 g); POST-T3 y POST-T10: 3 y 10 días luego de tratamiento, respectivamente.

Se identificaron 370 funciones metabólicas distintas, 130 de las cuales (35%) fueron diferentes (P < 0,05) comparando las muestras PRE-T y POST-T. Las funciones asociadas a la biosíntesis de nucleósidos/nucleótidos, y de cofactores y vitaminas fueron las más afectadas luego de la exposición a ricobendazol.

Los resultados presentados son los primeros en reportar alteraciones en el microbioma (disbiosis) asociado al uso de antihelmínticos en vacunos, complementando información ya generada en otras especies (Kunz et el., 2019).

Se concluye que la exposición a ricobendazol generó cambios significativos en la diversidad, composición, y funcionalidad del microbioma en heces de novillos hasta 10 días post-tratamiento, independientemente del nivel de hpg PRE-T. Dicha “reorganización” de microbioma puede contribuir a la mejora productiva de los animales que generalmente se observa POST-T, aunque se requieren estudios abarcando más animales y de más largo plazo para evaluar si el microbioma retorna a su composición original.