Evaluación del rango de detección de una RT-PCR en tiempo real (QRT-PCR) para rubulavirus porcino empleando cepas obtenidas desde 1980 hasta 2013

La enfermedad del ojo azul en los cerdos, es una infección viral endémica causada, por el Rubulavirus porcino (RVP), afecta principalmente a la zona del bajío y centro del país. Se han identificado tres grupos genéticos, con base en la secuencia del gen HN (1). Esta variabilidad no ha sido reportada en genes conservados, como tal es el caso del gen N. La detección del genoma viral (N., P y HN) por qRTPCR se ha realizado con las cepas aisladas hasta el 2003. Sin embargo, se desconoce si los métodos de diagnóstico molecular son capaces de detectar las diferentes cepas y aislamientos del RVP antiguos y recientes (1980-2013). El objetivo de este estudio fue evaluar una qRT-PCR en tiempo real para el diagnóstico de cepas del RVP caracterizadas (1980-2006) y de aislamientos virales recientes (2013).

 

Para la evaluación de la prueba se emplearon nueve cepas del RVP aisladas en cultivo celular, del año 1980 al 2003 (PPMV, LPMV, PAC1-6, 9) y siete aislamientos virales obtenidos en el año 2013 (procedentes de Michoacán, Guanajuato y Querétaro). Se amplificó por qRT-PCR una región del gen N del RVP. Se emplearon un par de iniciadores y una sonda marcada con FAM previamente diseñada por nuestro grupo de investigación. Todos los ensayos se realizaron por triplicado, como control positivo se empleó la cepa de referencia LPMV. Como control negativo de la reacción se empleó agua libre de nucleasas, ARN extraído de células PK-15 sin infectar y ARN de otros virus porcinos (PRRS y virus de influenza porcina). Para la curva estándar se empleó un ARN transcrito in vitro elaborado bajo condiciones experimentales (2).

 

El límite de detección de la prueba con base en la curva estándar empleando el ARN sintético, fue de 10² a 10¹⁰ copias de ARN/ µl, la pendiente fue -3.14 y el coeficiente de correlación (R²) de 0.99 (Fig. 1). Todas las cepas y aislamientos virales fueron positivos y presentaron una carga viral promedio de 3.04 × 10¹¹ (PPMV, LPMV, PAC1- 6, 9) y 3.82 × 10¹⁰ (RVP/INIFAP) copias de ARN/ml, respectivamente (Cuadro 1). La especificidad de la prueba fue del 100% ya que no se registraron reacciones cruzadas con ARN de otra fuente y además fue completamente sensible ya que todas las cepas o aislamientos empleados fueron amplificados.

 

Figura 1. Curva estándar construida con el transcrito in vitro del gen N del RVP

 

Cuadro 1. Datos y resultados de las cepas y aislamientos del RVP empleados para la evaluación de la qRT-PCR

 

Se logró validar la prueba al detectar a la totalidad de las cepas y aislamientos caracterizados en los últimos 33 años, por lo que el espectro de detección es adecuado a las condiciones actuales de la enfermedad. Con la evaluación de la prueba, empleando cepas y aislamientos del RVP que se han obtenido en más de 30 años de investigación, se cuenta con una herramienta de alta sensibilidad y especificidad que podría coadyuvar en el establecimiento de medidas de control o erradicación de la EOA.

 

1. Sánchez-Betancourt et al., 2008. Res Vet Sci. 85: 359-67

2. Rivera-Benítez et al., 2013. Arch of Virol. 158: 1849-56

Proyecto financiado por Proyecto Recursos Fiscales, INIFAP, No. 19144832016 y PAPIIT IN 208814-3