Evaluación del efecto antiviral in vitro del extracto etanolico del propóleo hacia el rubulavirus y parvovirus porcino

El propóleo es una sustancia resinosa, balsámica, gomosa, de consistencia viscosa, que las abejas elaboran a partir de exudados de diversas plantas, de color pardo–rojizo hasta el amarillo–verdoso, posee un sabor acre o picoso y algunas veces amargo ^(1,3). Su composición es muy heterogénea, no obstante numerosas sustancias se encuentran presentes de modo constante y relativamente estables, condicionando sus propiedades físico-químicas y biológicas, se sabe que son una mezcla químicamente compleja, algunos pueden tener más de 150 compuestos activos ⁽³⁾. Dentro de estos los polifenoles son el grupo más importante de compuestos representando hasta el 50% del total, destacando los flavonoides como el grupo más abundante y con las mejores actividades biológicas (1). El propóleo ha mostrado tener un importante efecto para controlar diversos agentes infecciosos incluidos los virus ^(2,3,5). El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto antiviral in vitro del extracto etanolico de propóleo (EEP) del estado de Zacatecas y del Distrito Federal contra el Rubulavirus y Parvovirus porcino.

Propóleos. Se utilizaron dos muestras de propóleos mexicanos, una procedente de la zona rural del Distrito Federal y la otra del Estado de Zacatecas, ambas se recolectaron en invierno del 2014 y fueron obtenidas por el método de raspado ⁽³⁾. Se guardaron en frascos de vidrio color ámbar, a una temperatura de -4°C hasta el momento de su extracción.

Extracción etanólica del propóleo (EEP). Se retiraron manualmente todas las impurezas, se pesaron y se colocaron de forma independiente en un sistema de extracción continua Soxhlet ^(4), se adicionaron 700 ml de alcohol etílico sin desnaturalizar de 96° en el contenedor del equipo y se realizó el proceso de extracción por un período de cinco horas. Después los extractos etanólicos se conservaron por 12 horas a 4°C, con el propósito de precipitar las ceras que contenía y se filtraron al vacío en un matraz Kitasato, con papel filtro No. 1. Por último, se colocaron los extractos de forma independiente en un matraz bola y se concentraron con el auxilio de un rotoevaporador hasta que se formó una masa viscosa. Terminado el proceso se preparó una solución Stock de trabajo de 10 mg/ml.

Material biológico: virus. Para el Rubulavirus porcino se utilizó la cepa de referencia OA-AV7-S-128, y para el Parvovirus porcino, se utilizó un antígeno vacunal ‘Parvovirus Vaccine: Killed Virus (Suvaxyn® P, Fort Dodge Animal Health), que fueron proporcionados por el Departamento de Medicina y Zootecnia de Cerdos de la Universidad Nacional Autónoma México.

Titulación viral. Los virus utilizados fueron titulados mediante la realización de diluciones dobles seriadas, resultando los siguientes títulos: Rubulavirus porcino 1:64 y para Parvovirus porcino 1:256.

Evaluación del efecto antiviral del propóleo. Se utilizaron las siguientes concentraciones del propóleo, 10mg/ml, 5mg/ml y 2.5mg/ml de acuerdo a trabajos previos ^(2,5).

Para evaluar el efecto antiviral del EEP, se realizaron titulaciones por triplicado de cada de uno de los virus contra cada una de las diferentes concentraciones mencionadas y a cuatro diferentes tiempos de interacción (0, 30, 60 y 120 minutos), esto con base a trabajos previos ^(1,2).

Para cada uno de los EEP y de los virus utilizados se procedió de la siguiente manera:

1. Se utilizaron 3 grupos de placas para cada una de las concentraciones y para cada una de estas, 4 placas una por cada tiempo.
2. Por otro lado, se realizó la confrontación del 500μl de cada uno de los EEP con 500μl de cada virus en tubos vacutainer, donde se homogeinizaron y se dejaron incubar los tiempos señalados.
3. Posterior a esto, se realizaron las diluciones dobles seriadas en los juegos de placas mencionados a volúmenes de 50μl.
4. Se agregaron 50μl de eritrocitos al 0.5% de bovino para el Rubulavirus porcino y de cobayo al 0.75% para Parvovirus porcino en todas la placas.
5. Se empleó un control de virus origen y uno de eritrocitos.
6. Se dejaron incubando a temperatura ambiente durante 30 minutos y se realizó la lectura.

Análisis estadístico. Con el propósito de determinar si existían diferencias estadísticas del efecto antiviral para cada uno de los EPP se utilizó un análisis de varianza mediante el programa estadístico SAS (versión 9.0; 2002).

Respecto al Rubulavirus porcino, se observó que el EEP del DF presentó una titulación promedio menor (5.3) a comparación a la encontrada con el EEP de Zacatecas (13.3), lo cual difiere significativamente (F=75.4, P<.0001). En el caso de Parvovirus porcino la titulación promedio fue menor y significativa (F=22.5, P<.0001) con el EEP de Zacatecas (56) a comparación con el del DF (65.3).

Con relación a las tres concentraciones de EEP utilizadas, se observó que existió efecto significativo para Rubulavirus y Parvovirus porcino, independientemente del tiempo de interacción y lugar de procedencia del propóleo, resulto ser mejor a una concentración de 5 mg/ml para el Rubulavirus porcino mostrando diferencias con las otras dos, mientras que para el Parvovirus porcino presento menor titulación a 5 mg/ml y 10 mg/ml sin tener diferencias significativas entre estas (Cuadro 1). Serkedjieva et al (1992) estudiaron el efecto de algunas sustancias sintéticas encontradas en el propóleo así como el mismo propóleo contra el subtipo H3N2 de influenza, encontrando una considerable reducción de la hemaglutinina a concentraciones 2.5 y 5 mg/ml. subtipo H3N2 de influenza, encontrando una considerable reducción de la hemaglutinina a concentraciones 2.5 y 5 mg/ml.

Se ha demostrado que compuestos fenólicos encontrados en el propóleo mostraron un efecto antiviral a 0 h, 1 h y a 2 h de interacción, contra el virus del distemper canino en cultivos celulares ⁽¹⁾. Los tiempos evaluados mostraron diferencias significativas en cada uno de ellos; los valores promedio de titulación en los diferentes periodos de tiempo y para ambos virus se muestran en el Cuadro 2, evidenciando con esto que a mayor tiempo de interacción menor título viral, lo cual es coincide con González (2013), que utilizo propóleo procedente del estado de México redujo las unidades formadoras de placa (UFP) del virus de la Enfermedad de Aujeszky en un cultivo tratado con 0.5 mg/ml de propóleo dos horas antes de ser infectado.

En el presente estudio, se encontró que el extracto de propóleo procedente del DF obtuvo una mayor inhibición frente al Rubulavirus porcino, en comparación con el de Zacatecas, contrariamente, se observó que para el Parvovirus porcino las mayores reducciones del título se obtuvieron con el propóleo de Zacatecas, lo anterior probablemente se debe a que la composición del propóleo es muy heterogénea, esto depende de varios factores: origen vegetal, zona geográfica, época de recolección, raza de abejas, condiciones climáticas, estado de la colmena y alimentación de la misma⁽³⁾, así como en la susceptibilidad de los virus a los componentes de los propóleos. Se ha reportado que existen diferentes componentes que integran a los propóleos y esta variación de compuestos hace que la mayoría de los microorganismos no se vuelvan resistentes al propóleo.

La actividad antiviral encontrada en el propóleo como en sus diferentes compuestos aún no ha sido determinada con certeza, sin embargo surgen supuestos de las diferentes formas de acción, Carvalho et al. (2013) menciona que el efecto antiviral puede ser debido a una acción directa para inactivar las partículas virales, por la razón de que tal vez conduce a su desestabilización o el bloqueo de interacción del virus con la célula.

Se encontró que ambos EEP Mexicanos estudiados fueron efectivos contra Rubulavirus y Parvovirus porcino de manera significativa (P<0.001), por lo que es de interés realizar más estudios para ampliar la información de las propiedades de este producto natural.

1. Carvalho et al. (2013). Research in Veterinary Science 95:717-724.

2. González B. M.J. (2013). Tesis de M. en C. UNAM.

3. González G. A. y Bernal M. R. (1997). Propóleo: un camino hacia la salud. Ed. Cuarto día, Primera edición.

4. Martínez et al. (2005) Revista CENIC, Vol. 36, No. Especial.

5. Serkedjieva et al. (1992). Journal of Natural Products 55(3):294-297.