Actividad bactericida de las sales alcalinas de ácidos grasos contra bacterias asociadas con el procesamiento de aves

Introducción

Actualmente se utilizan varios compuestos químicos como higienizantes en las plantas comerciales de procesamiento de aves para el consumo humano, con el fin de reducir la contaminación microbiana (Oyarzabal, 2005). El cloro es el desinfectante utilizado más ampliamente en este tipo de instalaciones en Estados Unidos, pues es económico y relativamente efectivo contra los microorganismos que se encuentran en el ambiente de estas plantas (Russell y Keener, 2007). La investigación reciente ha indicado que el uso del cloro durante el procesamiento puede generar la producción de compuestos carcinogénicos, como por ejemplo los trihalometanos. Otros desinfectantes utilizados para este fin son el clorito de sodio acidificado, el fosfato trisódico, el cloruro de cetilpiridinio, el bióxido de cloro y algunos ácidos orgánicos. A pesar del uso de estos compuestos higienizantes, se sigue citando ampliamente a la carne de ave contaminada con bacterias patógenas, como causa significativa de enfermedades de origen alimentario en humanos (Friedman et al., 2004).

Los ácidos grasos (FA, por sus siglas en inglés) son microbicidas que se presentan en la naturaleza y que cuentan con una larga historia como limpiadores de uso seguro y como conservadores de alimentos (Kabara et al., 1977). Estas sustancias son componentes de numerosos aceites de origen animal y vegetal, con poca capacidad tóxica para el humano, o bien son completamente inocuos. Los ácidos grasos han sido reconocidos "generalmente como seguros" (GRAS) por las dependencias gubernamentales. Las sales de potasio o sodio de ácidos grasos se forman cuando éstos se disuelven en soluciones de hidróxido de potasio (KOH) o hidróxido de sodio (NaOH), respectivamente. Estas sales alcalinas de ácidos grasos son surfactantes que también poseen actividad antimicrobiana. Las sales alcalinas de ácidos grasos pueden inhibir el crecimiento de varias bacterias y levaduras asociadas con el procesamiento de aves in vitro (Hinton e Ingram, 2005), en la piel (Hinton e Ingram, 2003) y en las canales enteras de pollo de engorde (Hinton et al., 2009). Se han examinado las sales alcalinas de ácido láurico como posibles higienizantes del procesamiento de aves, aunque para este mismo fin se podrían utilizar también otros ácidos grasos antimicrobianos (Amalaradjou et al., 2006; Bergsson, et al., 2002; Hermans et al., 2010; Solis de los Santos et al., 2008).

El método de difusión en agar se puede utilizar para examinar la actividad antimicrobiana de antibióticos y otras sustancias inhibidoras (Boney et al., 2008). La prueba se realiza colocando a los agentes antimicrobianos que se desee analizar en pozos de agar o sobre discos de papel sobre placas de agar sembrados con microorganismos problema. Las sustancias inhibidoras se difunden hacia la gelosa sembrada durante la incubación y se producen áreas de inhibición del crecimiento microbiano en los lugares donde hay presencia de concentraciones de la sustancia en prueba. Por lo tanto, el análisis de difusión en gel de agar se puede utilizar como prueba rápida eliminatoria de compuestos antimicrobianos potenciales con actividad inhibidora contra los microorganismos problema. El propósito del presente estudio fue examinar la capacidad de la prueba de difusión en agar para evaluar la actividad antibacteriana de formulaciones de sales alcalinas de varios ácidos grasos contra bacterias asociadas con el procesamiento de aves para el consumo humano.

Material y Métodos

Se desarrollaron aeróbicamente cultivos frescos de Acinetobacter calcoaceticus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella Typhimurium y Staphylococcus simulans, en Caldo Tripticasa Soya, marca Difco. Todos los cultivos se incubaron a 35^oC excepto L. monocytogenes, que se incubó a 30^oC, durante 18 a 24 horas, a 100 rpm en un agitador giratorio con baño María Modelo D76. Los cultivos de Campylobacter jejuni se desarrollaron en gelosa sangre (Becton Dickinson, and Co.) suplementada con 7% de sangre lisada de equino durante 48 horas, a 42^oC, bajo condiciones microaerofílicas en una jarra BD BBL GasPak, con un sistema de bolsa generadora de gas BD GasPak^TM EZ Campy. Todos los cultivos se cosecharon y se suspendieron en una solución al 0.1% de bactopeptona (Difco) para producir suspensiones bacterianas con un nivel de 10⁷ unidades formadoras de colonias (UFC)/ml.

El medio de gelosa atemperado se sembró con cultivos bacterianos para producir un medio de agar inoculado que contenía 10⁶ UFC/ml. Las suspensiones de bacterias se mezclaron en agar tibio y alícuotas de 25 ml de este agar se depositaron en cajas de Petri para producir una capa de agar de aproximadamente 6.5 mm de espesor.

Se prepararon sales alcalinas de los ácidos láurico, cáprico, caprílico, caproico y mirístico, disolviendo 0.5 M de cada ácido graso en volúmenes separados de KOH 1 M. El pH de estas mezclas se ajustó a 10.5 agregando soluciones diluidas de ácido cítrico a las mezclas de ácidos grasos. Todas las soluciones se filtraron para esterilizarlas, según se indicó ya.

Se utilizó un dispositivo de succión (Bell y Grundy, 1968) con tubos de metal para hacer concavidades de 8 mm en la gelosa solidificada y sembrada. Para cada prueba, las concavidades de las placas de gelosa se llenaron con 0.1 ml de la solución apropiada de ácido graso y KOH. Todas las placas, excepto las que se inocularon con C. jejuni, se incubaron en aerobiosis a 35^oC durante 18 a 24 horas. Las placas de gelosa sangre sembradas con C. jejuni se incubaron de manera microaerofílica a 42^oC por 48 horas. Después de la incubación se midieron las zonas de inhibición del crecimiento bacteriano alrededor de las concavidades en el agar, a partir del borde externo de la concavidad y hasta el área de crecimiento bacteriano visible utilizando un calibrador digital de fibra de carbono Traceable^Ò.

Todos los análisis estadísticos se realizaron con los programas de cómputo GraphPad StatMate^TM y GraphPad InStat^® versión 3.05 para Windows 95 (GraphPad Software, San Diego, CA, EE.UU.). Se realizaron análisis de varianza en un solo sentido (ANOVA) con pruebas de comparación múltiple de Tukey-Kramer para determinar las diferencias significativas entre las medias de los grupos. El valor de P de todos los análisis ANOVA fue <0.05.

Resultados y Discusión

En el presente estudio, las sales alcalinas de diferentes ácidos grasos presentaron variaciones en su capacidad de inhibir el crecimiento bacteriano (Cuadro 1). La combinación de ácido caproico y KOH presentó solamente actividad antibacteriana contra C. jejuni. La mezcla ácido caprílico y KOH inhibió el crecimiento de 3 de los aislamientos Gram negativos: C. jejuni, E. coli y P. fluorescens. El tamaño de los halos de inhibición de C. jejuni y P. fluorescens fue significativamente mayor que el de E. coli. Las mezclas de ácido cáprico-KOH y ácido láurico-KOH tuvieron actividad contra los 8 aislamientos bacterianos, en su totalidad. El tamaño de los halos de inhibición producidos por la mezcla ácido cáprico-KOH fue Salmonella Typhimurium < E. coli < A. calcoaceticus < L. monocytogenes y S. simulans < P. fluorescens < E. faecalis < C. jejuni. El tamaño de los halos de inhibición producidos por la mezcla ácido láurico-KOH fue E. coli < A. calcoaceticus < Salmonella Typhimurium y E. faecalis < C. jejuni, S. simulans y P. fluorescens < L. monocytogenes. La mezcla ácido mirístico-KOH sólo inhibió a los cocos Gram positivos E. faecalis y S. simulans, mientras que el tamaño de los halos de inhibición contra E. faecalis fueron significativamente mayores que los de S. simulans.

Se ha publicado que varios ácidos grasos tienen actividad antimicrobiana (Kabara et al., 1977). La actividad bactericida de los ácidos grasos se ha relacionado con la capacidad de estas sustancias de causar la lisis de las células bacterianas, rompiendo la membrana celular. La naturaleza compleja de la capa de lipopolisacáridos presente en las bacterias Gram negativas puede servirles de protección contra la actividad antibacteriana de los ácidos grasos. Entre los aislamientos Gram negativo, el frágil germen C. jejuni presentó el mayor nivel de susceptibilidad a la actividad bactericida de los ácidos grasos. Salmonella Typhimurium presentó mayor resistencia a los ácidos grasos de cadena corta cáprico y caprílico mezclados con KOH, que E. coli que presentó mayor resistencia al ácido láurico, que es de cadena más larga, mezclado con KOH. Las especies de Acinetobacter y Pseudomonas poseen paredes celulares similares pero Acinetobacter sp. tiene una membrana adicional desprendida que no se encuentra en Pseudomonas (Thorney y Sleytr, 1974), que puede dar a Acinetobacter un mayor grado de resistencia hacia los ácidos grasos que Pseudomonas. No obstante, la pared celular más gruesa de las bacterias Gram positivas puede ayudarles a tener resistencia contra la actividad antibacteriana de algunos ácidos grasos. En general, los ácidos grasos de cadena corta (como el ácido caprílico) tuvieron mayor efecto inhibidor sobre las bacterias Gram negativas, mientras que los de cadena más larga (como el mirístico) inhibieron mejor a las bacterias Gram positivas.

Cuadro 1. Tamaño de los halos de inhibición (mm) de las bacterias asociadas con las plantas de procesamiento de aves, con el uso de sales alcalinas de ácidos grasos

	Ácido Graso¹
Aislamiento Bacteriano	Caproico	Caprílico	Cáprico	Láurico	Mirístico
*Acinetobacter calcoaceticus*	0.00^a	0.00^a	4.39^c	2.43^ab	0.00^a
*Campylobacter jejuni*	5.97^b	4.97^c	14.97^g	4.04^c	0.00^a
*Enterococcus faecalis*	0.00^a	0.00^a	11.73^f	3.97^b	7.59^c
*Escherichia coli*	0.00^a	1.79^b	2.17^b	2.17^a	0.00^a
*Listeria monocytogenes*	0.00^a	0.00^a	5.44^d	10.15^d	0.00^a
*Pseudomonas aeruginosa*	0.00^a	4.47^c	6.70^e	4.72^c	0.00^a
*Salmonella Typhimurium*	0.00^a	0.00^a	0.15^a	2.97^b	0.00^a
*Staphylococcus simulans*	0.00^a	0.00^a	5.85^d	4.62^c	0.60^b

^{1 Los valores son promedios + la desviación estándar de los halos de inhibición (n = 15).}

^{A-G Dentro de las columnas, letras distintas indican diferencias significativas (P<0.05) en el tamaño de los halos de inhibición. Las sales alcalinas de estos ácidos grasos también son surfactantes, y la mezcla de ácido láurico con KOH tiene cierto potencial para ser utilizada como higienizante, pues puede reducir la contaminación de las canales de pollo de engorde evisceradas cuando se lavan por aspersión con estas mezclas (Hinton et al., 2009).}

Conclusiones

Los hallazgos del presente estudio sirven de evidencia adicional de que las sales alcalinas de varios ácidos grasos tienen acción bactericida contra varias bacterias asociadas con el procesamiento de aves para el consumo humano. Sin embargo, estos ácidos grasos presentan diferencias en su capacidad de inhibir el crecimiento bacteriano. Por ende, probablemente se requiera mezclar dos o más de estos ácidos para formular un producto higienizante con amplio espectro antibacteriano. Más aún, los resultados indican que la prueba de difusión en gel de agar se puede utilizar como método rápido para examinar la actividad inhibidora de las formulaciones de sales alcalinas de ácidos grasos.

Referencias

Amalaradjou MAR, Annamalai TV, Marek P, Rezamand P, Schreiber D, Hoagland T, Venkitanarayanan K. 2006. Inactivation of Escherichia coli O157:H7 in cattle drinking water by sodium caprylate. J Food Protect. 69:2248-2252.

Bell SC & Grundy WE. 1968. Preparation of agar wells for antibiotic assay. App Microbiol. 16:1611-1612.

Bergsson G, Steingrimsson O, Thormar H. 2002. Bactericidal effects of fatty acids and monoglycerides on Helicobacter pylori. Int. J Antimicrob Agents 20:258-262.

Boney B, Hooper J, Parisot J. 2008. Principles of assessing bacterial susceptibility to antibiotics using the agar diffusion method. J Antimicrob Chemother. 61:1295-1301.

Friedman CR, Hoekstra RM, Samuel M, Marcus R, Bender J, Shiferaw B, Reddy S, Ahuja SD, Helfrick DL, Hardnett F, Carter M, Anderson B, Tauxe RV. 2004. Risk Factors for Sporadic Campylobacter Infection in the United States: A Case-Control Study in FoodNet Sites. Clin Infect Dis. 38(Suppl 3), S285-296.

Hermans D, Martel A, Van Deun K, Verlinden M, Van Immerseel Garmyn FA, Messens W, Heyndrickx M, Haesebrouck KF, Pasmans F. 2010. Intestinal mucus protects Campylobacter jejuni in the ceca of colonized broiler chickens against the bactericidal effects of medium-chain fatty acids. Poult Sci. 89:1144-1155.

Hinton A Jr. & Ingram KD. 2003. Bactericidal activity of tripotassium phosphate and potassium oleate on native flora of poultry skin. Food Microbiol. 20:405-410.

Hinton A Jr. & Ingram KD. 2005. Microbicidal activity of tripotassium phosphate and fatty acids towards spoilage and pathogenic bacteria associated with poultry. J Food Prot. 68:1462-1466.

Hinton A Jr., Cason JA, Buhr RJ, Liljebjelke K. 2009. Bacteria recovered from whole-carcass rinsates of broiler carcasses washed in a spray cabinet with lauric acid-potassium hydroxide. Int J Poult Sci. 8:1022-1027.

Kabara JJ, Vrable R, Lie Ken Jie MSF. 1977. Antimicrobial lipids: Natural and synthetic fatty acids and monoglycerides. Lipids 12:753-759.

Oyarzabal OA. 2005. Reduction of Campylobacter spp. by commercial antimicrobials applied during the processing of broiler chickens: A review from the Unites States Perspective. J Food Prot. 68:1752-1760.

Russell S & Keener K. 2007. Chlorine-misunderstood pathogen reduction tool. Poult Int. 46:24-30.

Solis de Los Santos F, Donoghue AM, Venkitanaryanan K, Reyes-Herrera I, Metcalf JH, Dirain ML, Aguiar RVF, Blore PJ, Donoghue DJ. 2008. Therapeutic supplementation of caprylic acid in feed reduces Campylobacter jejuni colonization in broiler chicks. Appl Environ Microbiol. 74:4564-4566.

Thorney MJ & Sleytr UB. 1974. Freeze-etching of the outer membranes of Pseudomonas and Acinetobacter. Arch. Microbiol. 100:409-417.

Actividad bactericida de las sales alcalinas de ácidos grasos contra bacterias asociadas con el procesamiento de aves

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