Inmunomodulación en porcinos: Principios y alcances

En la actualidad la producción pecuaria en general, es una industria muy diferente a la de hace unos cuantos años. Los conocimientos sobre genética, nutrición, sanidad y manejo, han realmente transformado en forma acelerada la producción de alimento de origen animal. Ahora no sólo se produce un alimento de mejor calidad, sino más cantidad por unidad de superficie, por horas hombre, etc.

Desde el punto de vista manejo/sanitario, se practican programas de bioseguridad conjuntamente con programas de flujo de animales, que han contribuido a disminuir el contacto agente patógenoÛhuésped susceptible, esto se ve reflejado por ejemplo, en la mejora de ganancia de peso, mejora en conversión alimenticia, etc., realmente esta manera de producir a rendido frutos muy significativos. Ahora bien, a pesar de lo que se creía en un principio, las enfermedades siguen apareciendo, algunas nuevas o de reciente diagnóstico y otras antiguas pero con manifestación un tanto diferente a la forma en que la reconocíamos anteriormente, entre las nuevas para el caso de los porcinos tenemos Ileítis y Circovirus, otras antiguas pero de mayor diagnóstico en la actualidad Estreptococcosis, Espiroquetosis y Enfermedad de Glasser, y definitivamente las típicas, Neumonía enzoótica, Pleuropneumonía, Pasteurelósis, Salmonelósis y en algunos países más que en otros, Aujesky, Fiebre Porcina Clásica, Influenza, etc.

No quiere decir lo anterior que estas enfermedades están presentes en todas las granjas de producción intensiva, pero es un hecho que disponemos de hatos completos más susceptibles que antes a contraer enfermedades, no existe memoria inmunológica en ellos. Y si bien los programas de bioseguridad se ejecutan con estricta disciplina, en las granjas de tipo comercial (cerdo para consumo en carne), la esterilización de la granja parece ser todavía un mito.

De unos años para acá se habla de Inmunomoduladores, como una herramienta que podría ayudar a solventar en cierta medida algunos vacíos en la inmunidad que existen aún en las granjas más tecnificadas. En la realidad existe aún muchas dudas sobre ellos, su misma definición es aún tema de discusión en muchas reuniones. Mucha investigación se ha realizado alrededor de este tema y aún queda mucho por estudiar.

El motivo de esta presentación es dar a conocer, lo que hasta el momento sabemos del tema, los resultados obtenidos a nivel de laboratorio in vitro e in vivo, así como resultados de campo, que nos hacen confiar en que las expectativas de esta terapia pueden ser muchas sin apartarnos de las posibles limitaciones.

De manera sencilla podemos definir la Inmunomodulación como “ Acción fisiológica o farmacológica sobre el sistema inmune, optimizando su acción defensiva ante agresiones externas”.  Esta es una definición que abarca mucho, sin embargo podemos agregar que la inmunomodulación procura mediante el uso de substancias de origen biológico o químico, manipular el sistema inmunológico, estimulando un incremento o una depresión de la respuesta inmunitaria por parte del individuo. Aunque aún existen muchas dudas con respecto a los inmunomoduladores, se sabe que la mayoría de estas substancias actúan sobre células del sistema inmunitario induciendo la liberación o inhibición de medidores por parte de macrófagos, linfocitos T y B, y fibroblastos.

“Sustancia capaz de modificar la respuesta inmunitaria, actuando sobre la propia capacidad del huésped, sea específica o inespecíficamente según que esta modulación esté especialmente vinculada a un antígeno dado”.

Desde hace muchos años, algunos investigadores han descubierto diferentes elementos que al ser introducidos dentro del organismo, generan una reacción por parte del sistema inmune, entre ellos se han reconocido y estudiado glicanos fúngicos, Lipopolisacáridos (LPS), muramyl dipéptido, levamisol, etc. Algunos de ellos de uso en medicina humana.

A todas estas substancias se les atribuye algunos efectos sobre el sistema inmune que van desde activar fagocitos (macrófagos y neutrófilos), activación del tejido linfoide asociado a mucosas, maduración de órganos linfoides con proliferación de células del sistema inmune y hasta el establecimiento de un adecuado equilibrio de citoquinas.

Los productos más usados e investigados en medicina veterinaria son:

Creo conveniente, previo a presentar estudios  realizados por mi laboratorio con unas de estas substancias, hacer un recorrido breve pero que nos pueda dar una idea, de cómo actúa el sistema inmune ante una agresión.

Dentro de los mecanismos de protección contra agresiones de gérmenes provenientes del exterior, existen de tipo mecánicos, como el movimiento ciliar del tracto respiratorio, el efecto de la tos, el peristaltismo intestinal, etc., y químicos, la acidez del jugo gástrico por ejemplo. Pero el sistema inmune propiamente dicho es aún más complejo superado según algunos científicos únicamente por la organización y funcionamiento del sistema nervioso.

Es por todos sabido que el sistema inmune al igual que otros sistemas del organismo, se encuentra constituido por células (monocitos, macrófagos, neutrófilos, etc. de la línea mieloide, y Linfocitos B, Linfocitos T y células natural killer de la línea linfoide), tejidos (tejido linfoide asociado a mucosas)  órganos (médula ósea, timo, bazo), y substancias solubles (inmunoglobulinas, sistema de complemento, citocinas, etc.).

Los órganos básicamente van a proveer de células al sistema, de células capacitadas para reconocer cada una o cada clon de células, a un cierto tipo de antígenos que tengan algunas estructuras más o menos comunes. Estas células se encontrarán algunas de ellas circulando por todo el organismo y otras agrupadas en los lugares del organismo por donde más frecuentemente ingresan los organismos extraños, esto es las superficies mucosas, por ello se denomina Tejido Linfoide Asociado a Mucosas. En estos lugares los diferentes tipos celulares se encuentran en estrecho contacto, para permitir la transferencia de información de una a otra, y a su vez porque en estos lugares es más probable que puedan contactar con los diferentes antígenos. Algo muy importante dentro de esta estrecha relación intercelular es la forma de comunicación que existe entre ellas, esto se da por medio de substancias solubles conocidas como citocinas, Interleuquinas (IL) en este caso , que sirven como mensajeros y el mensaje de cada una de ellas repercute en una serie de acciones  por parte de la célula que recibe el mensaje.

Dentro de las células del sistema inmune existen las que denominamos Presentadoras Profesionales de Antígeno, destacan por un lado los macrófagos que engullen cualquier agente extraño, lo digieren y luego presentan partes de el a otro tipo de células(Linfocito-Th0), y por otro lado los Linfocitos B (L-B) que captan con receptores de superficie también antígenos solubles. Esto se da en parte porque este tipo de células poseen lo que se denomina Complejo Mayor de Histocompatibilidad del tipo II (CMH-II), es importante aclarar que debido a la presencia del MCH-II, estas células se convierten en las en las únicas junto con las dendríticas, que son capaces de presentar antígenos a los L-Th0, el resto de las células del cuerpo tienen el CMH-I, esto les ayuda a presentar antígeno a otro tipo de células, a los Linfocitos T citotóxicos y células Natural Killer, cuando han sido invadidas por agentes patógenos como en el caso de una infección viral, y lo que se persigue es la destrucción de la célula enferma con todo y su contenido. Veamos en forma gráfica como se desencadena el proceso hasta llegar a una respuesta de tipo humoral.



Dentro del marco de una reacción que inicie por ejemplo con la presentación de antígeno por parte de alguna célula presentadora profesional, es importante destacar que este es presentado a un linfocito conocido como L-Th0, y este define si se estimula más o menos un L-Th1 ó un L-Th2, en el caso de ser un L-Th1 la respuesta predominante será de tipo celular donde participan nuevamente las células Natural Killer y los linfocitos T citotóxicos apoyados  elementos solubles como el Factor de Necrosis Tumoral (TNF) y el Interferón (INF), esto es más común para enfermedades de tipo viral. Si por el contrario el estímulo es mayormente dado a la línea de L-Th2, la respuesta será del tipo conocido como humoral, es decir con la formación de Inmunoglobulinas (anticuerpos). Ahora bien esto está dado en gran parte por el tipo de citocinas que se produzca, por ejemplo la IL-12 actuará sobre los L-Th1 induciendo una respuesta de tipo celular, y la IL-4 actuará sobre los L-Th2 orientando la respuesta hacia una de tipo humoral, con la respectiva formación y secreción de anticuerpos por medio de L-B  que para ello se transforman en plasmocitos.

Existen además otras Interluquinas conocidas como proinflamatorias como es el caso de la IL-1, que contribuye a un incremento de temperatura, a linfoproliferación, al secuestro del hierro, etc. Ver Gráfica No.1.



Como se puede observar en la gráfica superior, son varias interleuquinas y su producción es lo que se denomina la cascada inmunológica, debido a que conservan un cierto orden de aparecimiento de acuerdo al estímulo inicial, sin embargo en un momento dado se entrecruzan en efectos y células donde actúan.

De cualquier manera el objetivo final es destruir al elemento que provoca daño al organismo, ya sea ubicado intracelularmente donde la respuesta será mayormente del tipo celular ó en forma libre donde será bloqueado, destruido o marcado con substancias solubles como los anticuerpos. 

De manera sencilla sin tocar muchos detalles, la descripción hecha hasta aquí del sistema inmune, permitirá comprender la importancia de los estudios realizados.

Entre muchos trabajos que no habría tiempo y espacio para comentar, revisaremos dos que se han realizado conjuntamente con la Unidad de Patología Infecciosa, Facultad de Veterinaria de la Universidad Autónoma de Barcelona y el Departamento de I+D de Laboratorios CALIER, estos se han efectuado  con la combinación de dos compuestos que poseen efectos sobre el sistema inmunológico, un Lipopolisacarido de E. coli (LPS) y una bacteria inactivada Propionibacterium granulosun (Pg), en uno de se determina la expresión in vitro de citocinas como respuesta a estos compuestos, por parte de macrófagos alveolares y células mononucleares de sangre periférica de cerdo y el otro el efecto que estos compuestos tienen al ser administrados simultáneamente con la vacuna de Aujesky.

En el primero de los trabajos, se utilizan cerdos Landrace-York de alta sanidad aportados por el Institut de Recerca i Tecnología Agroalimentaria (IRTA, Barcelona). Todos los procedimientos a los que fueron sometidos los animales fueron aprobados por la Comisión de Etica en Experimentación Animal y Humana (CEEAH) de la Universidad Autónoma de Barcelona.

Los macrófagos alveolares (MA) se obtuvieron mediante lavados broncoalveolares. Las células se ajustaron a una concentración de 1 x 105 células/ml dispensándose  un ml/pocillo de la suspensión celular en placas de cultivo de fondo plano de 24 pocillos. Las células se estimularon con estos compuestos que denominamos INMD (5mg/ml de LPS y 62,5 mg/ml de Pg), LPS (5mg/ml) o no fueron estimuladas las cuales actuaron como controles. Se realizaron cultivos por triplicado para cada estímulo y control. Los macrófagos y sus sobrenadantes fueron recogidos a los tiempos 0 (10 minutos post-estímulo), 1 h, 4 h, 6 h y 24 horas posterior al estímulo.

Para obtener las células mononucleares de sangre periférica (CMSP), se tomaron muestras de estos animales colectadas por punción de la vena yugular. Las células mononucleares fueron separadas por centrifugación en gradiente de densidad del resto de formas celulares usando el Histopaque 1.077 (Sigma). Las células mononucleares se ajustaron a una concentración de 1 x 106  células/ml y se dispensó 1 ml de esta suspensión celular en pocillos en placas de 24 pocillos. Se realizaron tres grupos y se estimularon como se menciono anteriormente para los macrófagos durante un período de 24 horas. Todos los cultivos (MA y CMSP) se incubaron a 37°C en atmósfera húmeda al 5% de CO2.

La producción de INF-g y TNF-a fue analizada mediante ELISA cuantitativo (Pig ELISA INF-g, Pig ELISA TNF-a, Endogen). La expresión de interleuquinas (IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 e IL-12) se evaluó mediante PCR de transcripción inversa (RT-PCR) semicuantitativa. Los perfiles de los productos de RT-PCR se analizaron mediante elctroforesis y observación bajo luz ultravioleta. Las bandas para cada una de las interleuquinas, observadas bajo la luz ultravioleta, se clasificaron del 1 al 5 de acuerdo a la intensidad de las mismas comparado con la enzima gliceraldehido-3-fosfato deshidrogenasa (G3PDH), (1: banda escasamente visible, 2: banda poco visible, 3: banda medianamente visible, 4: banda altamente visible, 5: máxima visibilidad de banda).

Los resultados en el caso de los macrófagos alveolares, demuestran que la expresión de citoquinas en los diferentes tiempos fue similar para las células estimuladas con INMD y LPS. En ambos casos se expresaron IL-1, IL-6, IL-12 y TNF-a, no detectándose IL-10. Sin embargo, los niveles de expresión y producción de estas citoquinas fueron menores para las células estimuladas con INMD que con LPS solo. No se obtuvieron niveles significativos de expresión de estas citoquinas en las células control.

En el caso de las células mononucleares estimuladas tanto con INMD con LPS expresaron IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 e IL-12 tras 24 horas de incubación. Los niveles de expresión de estas citoquinas fueron igualmente superiores en las células estimuladas con LPS que en las estimuladas con INMD, excepto para INF-g, cuya producción fue superior en las CMSP estimuladas con INMD que en las estimuladas sólo con LPS.

Este trabajo indica que el INMD fue capaz de inducir la expresión de citoquinas pro-inflamatorias, IL-1 y TNF-a, que forman parte de la respuesta inicial frente agentes infecciosos. Estas citoquinas poseen un espectro de actividad amplio y actúan sobre una variedad de células. La expresión de esta respuesta primaria indicaría que el INMD posee la capacidad de desencadenar todo el proceso de la respuesta inmune en el cerdo así como la capacidad de responder ante estímulos  antigénicos. Por otro lado, la expresión de IL-2, IL-4, IL-6 e IL-12 podría indicar que se estimulan los macrófagos y linfocitos induciéndose la promoción de la respuesta inmune celular y humoral, la proliferación y activación de estas células y la producción de anticuerpos, todo lo cual contribuiría a la protección y resolución de diferentes patologías.

El hecho de que la expresión de citoquinas, salvo en el caso de INF-g, fue menor en las células estimuladas con INMD que con LPS, indica que el INMD estimula la producción y liberación de citoquinas a niveles suficientes para producir efecto sobre la respuesta inmune pero no como para provocar reacciones adversas en el animal. Así se explicaría la capacidad de INMD para estimular los mecanismos inmunitarios sin los efectos adversos, como fiebre, diarrea, anorexia, letargia, decaimiento general, shock y muerte, que se pueden producir en el animal por efecto del LPS de bacterias y/o la liberación prolongada de citoquinas o altos niveles de las mismas. El efecto sobre el INF-g, pueden sugerir que en el animal, el INMD sería capaz de producir directamente la activación de los macrófagos, se incrementaría la fagocitosis y presentación de antígeno o los linfocitos TH (cooperadores o colaboradores), activación de células B, producción de anticuerpos, activación de células NK y endoteliales.

El otro estudio verifica el efecto positivo sobre la respuesta inmune humoral, en la producción del nivel de anticuerpos utilizando como coadyuvante en la vacunación de lechones contra la enfermedad de Aujesky. En ese ensayo se utilizaron 85 cerdos de una granja comercial de ciclo cerrado que se dividieron en dos grupos (A= 43 y B= 42). Aa todos los animales se les aplicó dos dosis de la vacuna contra la enfermedad de Aujesky y, adicionalmente, a los cerdos del grupo B les fue administrado 1 ml intramuscular de iNMD al momento de la aplicación de la primera dosis vacunal. Se pudo observar que el grupo de animales que recibió INMD (grupo B) presentó títulos medios geométricos  vacunales superiores (5,23±1,43) que  el grupo solo vacunado (4,17±1,70) tras la primera vacunación (p< 0,005). Así mismo el porcentaje de animales con valores serológicos de anticuerpos bajos (2) fue inferior en el grupo B (25,6%) comparado con el grupo A (56,1%).

Como lo indicara anteriormente, existen aún más trabajos realizados con INMD, sus efectos como coadyuvante de terapias anti-infecciosas, como programa en cerdas pre-parto, etc. que nos complace el observar que los límites de la asistencia que nos pueden procurar estos compuestos, aún no ha sido establecido. Es claro también que estos compuestos no constituyen substitutos de las vacunaciones, la antibioterapia correcta y mucho menos el buen manejo.


BIBLIOGRAFÍA