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Identificación de hongos en el proceso de compostaje de cadáveres de aves y residuos avícolas

Publicado: 26 de mayo de 2009
Por: Msc. Reinel Brito Rodríguez, Universidad de Valladolid. Campus
ANTECEDENTES
La biotecnología pretende hacer uso de la biodiversidad del planeta para producir o modificar sustancias útiles. Por ello, la relación entre biodiversidad y biotecnología es bastante estrecha (Muñoz, 1998). A mayor conservación y conocimiento de la biodiversidad, existirán más oportunidades para hacer uso del recurso. El desarrollo de nuevos productos y procesos -claves en el desarrollo futuro de la biotecnología- depende del hallazgo de nuevas fuentes de materiales biológicos, así como de la creatividad y de la capacidad de los investigadores para descubrir, evaluar y desarrollar dichas fuentes. Por tanto, métodos acertados de estudio de la biodiversidad conllevarán a aumentar la probabilidad de descubrir y desarrollar biotecnologías valiosas. (Mikan J,F. 2004)
La biología molecular es una disciplina relativamente joven, las primeras publicaciones acerca de esta se atribuye a Höss y Pääbo (1993) y además a Tuross (1994),ellos no solo permitieron en su momento profundizar en los fundamentos moleculares de estas dificultades sino que sentaron las bases para un estudio más profundo de ADNa, que excedía con mucho la mera recuperación de fragmentos mediante PCR. De hecho, fueron ellos los que establecieron que la extracción y amplificación del ADN antiguo se complica por todos aquellos mecanismos de descomposición que acompañan a las muestras enterradas o suficientemente antiguas (Arroyo E, 2003), originada en los años 30s y los 40s, e institucionalizada en los años 50s y los 60s. El período clásico de ésta comenzó en 1953 con el descubrimiento de la doble hélice del ADN por James Watson y Francis Crick. La relación científica de Watson y Crick unificó varios acercamientos disciplinarios: Watson, reconoció la necesidad de utilizar la cristalografía para aclarar la estructura del ADN, por lo que hicieron un uso amplio de datos a partir del trabajo de cristalografía con rayos X en ADN realizado por Maurice Wilkins y Rosalind Franklin en el King´s College, de Londres (Darden y Tabery, 2005).
Con la estructura del ADN a disposición (Watson y Crick, 1953), la biología molecular cambió su enfoque por lo que la estructura de la doble hélice ayudó a la elucidación de los mecanismos de replicación y función genética, las claves para entender el papel de los genes en la herencia. Esta investigación subsecuente fue guiada por la noción de que el gen era una molécula informativa (Darden y Tabery, 2005). La secuencia linear de las bases de los ácidos nucleicos a lo largo de una hebra de ADN proporcionó la información codificada para dirigir el orden linear de aminoácidos en las proteínas (Darden y Tabery, 2005).
En la actualidad, la aplicación de la biología molecular al estudio de la genética ha dado lugar a un crecimiento sin precedente en nuestro entendimiento del mecanismo básico de las enfermedades y las bases del nuevo campo investigativo de la medicina molecular y aplicados a otras ramas, ya que las bases genéticas de un gran número de enfermedades y microorganismos se están identificando, lo cual tendrá un impacto importante para el diagnóstico, pronóstico, e manejo identificación de los mismos (Glazer, A, 1995).
Las técnicas moleculares actuales han sido desarrolladas, en solo pocos años de investigación académica básica en muchos campos de la ciencia, entre ellos la agricultura, de tal manera que en los últimos años, seis de éstas técnicas han surgido como los métodos para el análisis y tipificación de los aislamientos de microorganismos e identificación para su posterior análisis, e importancia en determinadas ramas.
En este trabajo se demuestra la aplicación de esta parte de la ciencia en la agricultura, fundamentalmente en la identificación de microorganismos hongos que intervienen en el proceso de descomposición de residuos avícolas y cadáveres de aves, para la obtención de compost.
  
INTRODUCCIÓN 
Los  residuos  orgánicos  ocupan  en  el mundo  un  lugar  prioritario  desde  el  punto de  vista cualitativo  y  cuantitativo. Constituyen entre el 30  y el  65 % de  los  residuos domiciliarios,  según lugar y clima, más del 85% de los residuos considerados agrícolas y un porcentaje no  despreciable  de  residuos  industriales,  fundamentalmente  vinculados  a  las agroindustrias. (Sztern y col, 2002) 
Dar una respuesta a los residuos agrícolas, significa reducir sustancialmente el volumen de lo que consideramos residuos, la fracción orgánica  de los mismos será materia prima de los procesos de compostaje. 
El  compost  es  un  material  al  que  se  llega  por  biotecnologías  de  bajo  coste,  que  nos permite  mantener  la  materia  orgánica  dentro  del  ciclo  natural,  no  incinerándola  ni "ensilándola", con difícil y cara recuperación, como sería el caso de los rellenos sanitarios. Es un mejorador de suelos, sumamente útil en el combate a la erosión, en la mejora de los cultivos  en  cuanto  a  cantidad  y  calidad  de  los  mismos.  Su  producción  trae  beneficios directos e indirectos si consideramos los beneficios en la producción, la mano de obra que ocupa  su  procesamiento,  las  posibilidades  de  obtener  producciones  ambientalmente sanas, la disminución de materia a eliminar y su valor como elemento formativo ambiental. 
En última  instancia, el compost podemos considerarlo como un bien  "ambiental  - social": por  los  beneficios  ambientales  que  proporciona,  a  los  que  debemos  sumar  que  disminuye  la cantidad de agroquímicos requeridos por los cultivos donde es aplicado y al considerar que devolvemos a la sociedad un bien que fue generado por ella, evitando el agotamiento del humus y tierras productivas.  
Estos pueden ser elaborados a partir de diferentes materias, pero nuestro trabajo se centra en la identificación de los microorganismos que intervienen en el proceso de descomposición de la materia utilizada, siendo ésta los de cadáveres de aves, el mundo de las ciencias biológicas ha desarrollado varias investigaciones y métodos para acercarnos cada día más a la realidad y probabilidad del tema a investigar. Los estudios de estos microorganismos serían imposibles sin los adelantos de la Biología Molecular como ciencia para el desarrollo e investigación de la identificación de estos microorganismos a partir de su ADN y otras características y pruebas a realizar con este fin. 
Las secuencias de ADN se utilizan cada vez más en los análisis filogenéticos debido a que unos pocos cientos de bases, con su cantidad enorme de combinaciones potenciales, bastan para hacer análisis de identificación y parentesco. Por eso algunos autores, como Herbert et al. (2003), y Tautz et al. (2003), proponen un rol central del ADN en la definición de las especies, de forma que una muestra de ADN y la lectura de su secuencia de bases debería ser uno de los caracteres del espécimen tipo, y una especie de marca para el taxón al cual pertenece el espécimen. Se ha propuesto que la secuencia de ADN sirva como un carácter clave, de utilización similar a como se usaría el código de barras en los supermercados. Esta "Taxonomía basada en ADN" aún adolecería de muchos de los mismos problemas que tienen los demás enfoques: por ejemplo, el problema de los límites de la circunscripción de los taxones. 
Otro problema es que hay que decidir qué secuencia usar, ya que algunas secuencias no dan una información que diferencie al taxón de los demás (Mallet y Willmott 2003). Esto puede ser porque un mismo gen puede mantenerse inalterado durante millones de generaciones después de la especiación, o debido al fenómeno de introgresión (de forma que un gen que se había diferenciado vuelva a su estado anterior por azar), por lo tanto, de la misma forma en que no es conveniente confiar en un solo carácter morfológico para identificar una especie, tampoco es conveniente confiar en una sola secuencia de ADN (Mallet y Willmott 2003). Aún cuando la "Taxonomía basada en ADN" fuera financiada, es necesario preguntarse si es necesario agregar un requerimiento extra al ya lento proceso de describir nuevos taxones, en especial teniendo en cuenta que se calcula que sólo el 10 % de las especies del planeta ha sido descrito (Mallet y Willmott 2003). Debido a eso, probablemente la mayoría de los biólogos verán a las secuencias de ADN como un complemento más que como un reemplazo de la información morfológica. 
De todas formas, los Códigos de Botánica y Zoología hoy en día no especifican ningún carácter en particular para diagnosticar nuevos taxones, así que la "Taxonomía de ADN" ya es válida, si bien la descripción de caracteres visibles puede ser de uso más inmediato y definitivamente más interesante que la lectura de las secuencias de ADN. Ya es rutina que las especies de microorganismos se delimiten a través de métodos moleculares, y, para dilucidar el árbol de la vida completo, sería claramente útil secuenciar los mismos genes en muchos taxones diferentes. 
Para identificar nuestros hongos se aislaron microorganismos de muestras de compost de residuos avícolas, empleando la técnica de diluciones seriadas y siembra en superficie. Las muestras se tomaron de los diferentes procesos del compostaje en las Granjas Avícolas de Villamuriel de Cerrato en Palencia hasta su maduración total, estas se realizaron con un émbolo cilíndrico con barra succionadora previamente esterilizada. En la fase de maduración de Villamuriel se recogieron muestras a tres niveles del compostador (alto, medio y bajo), las cuales se analizaron y procesaron a nivel de laboratorio donde se montaron las más compactadas en cámaras húmedas, realizadas con placas de petri de 10 cm de diámetro, para estimular el crecimiento de algún micelio fúngico existente, proporcionándonos presencia de hongos solo en la muestra obtenido en la parte de superior del compost en su última fase y lista para cosechar. de cultivos de PDA (patata, dextrosa, agar), una vez establecido y elaborado este medio se depositó una pequeña porción de cada muestra en vivo en cada placa de petri con el medio de cultivo. 
Los microorganismos que crecieron en los medios con pared celular vegetal fueron purificados por cultivos monospóricos (hongos). Estos cultivos se reaislaron utilizando, Agar-PDA para hongos (Ramírez, 1996), conservándose en medios de cultivo sólidos con pared celular vegetal como única fuente de carbono hasta su posterior utilización. De esta manera se pudo obtener un mejor desarrollo y aislamiento de los microorganismos. 
Hace algunos años hasta los '80 se identificaban los hongos por la vía tradicional usando las claves dicotómicas para llegar a saber qué hongo se encontraba aislado, esto se realizaba a través del montaje en portaobjeto de pedazos de micelios, esporas y esporangios de ellos, y seguidamente se observaba en un microscopio para comparar las características físicas de ellos con las enumeradas en las claves, que incluía fotos de estas partículas también, en ellas se detallaban los clores de micelio etc... este trabajo se hacía muy engorroso y suponía una gran pérdida de tiempo, además de que nunca la identificación superaría el 90 % de semejanza. 
Una vez entrada las investigaciones y avances con la identificación, aislamiento y procesamiento del ADN, esto supuso un gran avance y mejora en cuanto a identificación de microorganismos se refiere, naciendo así la secuenciación de ADN, con esta técnica se aísla el ADN y se procesa a través de la replicación por PCR y luego de realizar la electroforesis de esta se puede secuenciar, en esta secuenciación nos muestras el % de semejanza de cada microorganismo, que responde al semejante establecido en un banco de ADN de microorganismos existente e incorporado por diferentes investigadores, la semejanza aquí supera el 98 %, y casi siempre establece un 100 %, por esta vía se ahorra en tiempo y nos aseguramos de la veracidad del microorganismo. 
En este trabajo nos trazamos como objetivo establecer una metodología adecuada para la identificación de hongos en el proceso de compostaje de residuos avícolas, a través del análisis y valoración en el laboratorio.

MATERIALES Y MÉTODOS
 
 Este trabajo se realizó en una Granja Avícola de Castilla y León, en Villamuriel de Cerrato, en los meses de julio a septiembre de 2007. 
Para esta investigación se utilizaron 3 reactores del tipo compostador cerrado diseñados por la Universidad de Valladolid, específicamente la Facultad de Agronomía en Palencia, con una capacidad aproximada de 3.70 m3 cada uno, con dimensiones de 2.37 m de largo, 1.42 m de ancho y 1.08 m de alto; en los cuales se depositaba la materia prima con el fin de lograr la descomposición de los cadáveres de aves y cerdos para la obtención del compostaje. Estos poseen un dispositivo de aireación, riego y registro de temperaturas automatizados, encargado del control automático de todo el proceso de compostaje, incluso el aumento de temperatura en caso que se necesite, fundamentalmente en las épocas de invierno. 
Estos compostadores se ubican en las Granjas y desde allí se realizan todas las operaciones de carga y descarga, así como la toma de muestras para su posterior análisis en laboratorio. 
La materia prima utilizada en Villamuriel de Cerrato fueron cadáveres de gallina y cerdos, para su mejor descomposición y aireación se les agregó paja de cereales y gallinaza. En Hibramer por su parte se utilizó paja, gallinaza, cáscara de huevo y torta de la depuradora que hay en el Centro, todo esto combinado con los cadáveres de las aves.
 
Forma del llenado de los compostadores. 
El llenado consiste en una sucesión de capas, en las que se utilizan varios materiales: 
Paja: Ayuda en el empapado del exceso de agua y los lixiviados procedentes de la biodegradación, además aumenta la relación C/N de la mezcla (Se aplicará 0,1 veces el peso de los cadáveres). 
Gallinaza: Es el único material compactante que se añade a la mezcla (Se añade entre 1,5 y 2 veces el peso de los cadáveres. Contando que hay que cubrirlos suficientemente, a veces pasa de 2 veces el peso), este material hace un agran aportación de microorganismos capaces de compostar los cadáveres, lo que nos sirve como inóculo. 
Gallinas o Cerdos: se introducen los cadáveres en el compostador y se tapan con gallinaza. Hay que tener cuidado a la hora de añadir los cadáveres, ya que, no pueden estar cerca de la pared del compostador (a 15 cm aproximadamente) porque se compostan muy poco y hay partes que ni siquiera se compostan, como por ejemplo, las patas de gallina y algunos huesos. 
Se procederá al llenado insertando primero la capa de paja, después gallinaza, cadáveres, gallinaza y así sucesivamente hasta que se llene el compostador. La última capa siempre será de gallinaza, tendrá un espesor de 10-15 cm y cubrirá completamente los cadáveres. Una vez completado el llenado se pasa a la fase de seguimiento. Esta fase se realiza durante toda la evolución de la mezcla al compost. Varias veces por semana se repite el proceso de seguimiento que consiste en la medición de los gases desprendidos por el proceso, la medición de la humedad de la mezcla y la anotación del dato diario de temperaturas. Una vez a la semana se toma muestra.


Toma de muestras
En la preparación de la muestra se tuvieron en cuenta las siguientes consideraciones: 
  • El instrumento para colectar las muestras debe estar esterilizado y sin restos de suciedad o de muestras anteriores.
  • El peso de la muestra debe ser aproximadamente de 0.5 hasta 1 gramo, aunque puede variar en función de la humedad y la edad del material. La cantidad de muestra ha de ser la mínima suficiente para hacer el ensayo por duplicado y para poder determinar los microorganismos suficientes.
  • Cualquier tipo de muestra se ha de homogenizar bien para lograr tomar la mayor cantidad de esporas posibles.
  • El contenido de humedad de la muestra ha de situarse entre el 35-55 %, de este modo se asegura que no haya limitaciones de la actividad microbiana al encontrarse el material demasiado húmedo o demasiado seco.
  • Deben procesarse lo más fresca posible y en su defecto mantenerse a 4 grados hasta 15 días.
Las muestras se tomaron de los diferentes procesos del compostaje en las Granjas Avícolas de Villamuriel de Cerrato en Palencia hasta su maduración total, estas se realizaron con un émbolo cilíndrico con barra succionadora previamente esterilizada. En la fase de maduración de Villamuriel se recogieron muestras a tres niveles del compostador (alto, medio y bajo); se analizarán un total de 26 muestras, 11 pertenecientes a compostaje de gallinas y 7 pertenecientes a compostaje de cerdos, de la Granja Avícola de Villamuriel; además de 4 muestras de la Granja Avícola de Hibramer (éstas en las fases correspondientes a las fecha de recogida de las muestras). Hasta el momento solo se han analizado las 11 de gallinas, 7 de cerdos y las 4 de Hibramer centrándonos en la fase final de las anteriores.
 
Procesamiento de las muestras. 
Estas se llevaron al laboratorio se montaron las más compactadas en cámaras húmedas, realizadas con placas de petri de 10 cm de diámetro, para estimular el crecimiento de algún micelio fúngico existente, proporcionándonos presencia de hongos solo en la muestra obtenido en la parte de superior del compost en su última fase y lista para cosechar. 
Seguidamente se aplicó la técnica de diluciones seriadas y siembra en superficie preparándose diferentes medios de cultivos para desarrollar en ellos los microorganismos presentes en las muestras como tal, a fin de aislar los presentes. 
Se realizaron para ello medios de cultivos de PDA (patata, dextrosa, agar) y se le colocaron pequeñas porciones de muestras del composta.  En este caso los hongos se pusieron a crecer entre 25 y 27. 
Las siembras se observaron diariamente, teniendo a las 72 horas resultados ya concretos del crecimiento de algunas bacterias, al igual que se observó el crecimiento de micelios en el caso de los hongos. A las 120 horas se tomaron todas las muestras y se aislaron por cada microorganismo presente, con el fin de realizar las PCR y demás pruebas pertinentes para su identificación. 
Una vez aislados y crecidos los microorganismos se les realizó una PCR para extraer el ADN y de esta manera comparar con el registro establecido para la identificación de ellos, al realizar la primera gelificación nos dimos cuenta que había exceso de ADN, con lo cual hubo que realizar una siembra de las bacterias en medio líquido y en el caso de los hongos tomar menos cantidad de micelios para esta prueba.


IDENTIFICACIÓN GENÓMICA DE HONGOS:
Obtención de ADN genómico en hongos: Las extracciones de ADN se realizaron a partir de micelio fresco crecido en placa de petri a 25ºC en medio PDA, utilizando REDExtract-N-Amp Kit (XNAP) (Sigma, ST. Louis, Missouri, USA) siguiendo las instrucciones del proveedor. Seguidamente se realizó la amplificación con el mismo Kit. 
Análisis mediante PCR: Las reacciones de amplificador se llevaron a cabo en un termociclador Gene Amp PCR System 9700 (Applied Biosystems). Los oligonucleótidos iniciadores fueron suministrados por IZASA (Barcelona, España). 
Amplificación y secuenciación: Se realizó con cebadores universales mediante los oligonucleótidos universales ITS4 e ITS5 (White y col, 1990). Preparación: Con volumen final de 30 μl utilizando 1X REDExtract-N-Amp, Tampón de PCR (XNAP Kit), 0.4 μlM de cada uno de los oligonucleótidos  iniciadores ITS4 e ITS5 más 20 ng de ADN fúngico. 
Para el ciclo de desnaturalización se empleó el siguiente diseño: 
  • 3 Min. A 94º C
  • 35 ciclos a 94º C durante 1 min. (desnaturalización) + 1 min. a 58º C (hibridación) + 1 min. A 72º C (extensión), y se concluye con un ciclo de extensión final a 72º C durante 10 min.
  • Luego se carga una alícuota de cada producto de PCR en un gel de agarosa al 1 % y posteriormente se purifican los fragmentos, se procede a la cuantificación y secuenciación para comparar en la Base de Datos NCBI y se identifican. 
La ampliación utilizada es a 580 pb para un total de 120 minutos. 
La gelificación para la electroforesis se realizó con agarosa que es un polímero lineal de galactosa que se disuelve en agua hirviendo y forma un gel cuando se enfría. La concentración del material en el gel determina el tamaño de los poros que son mucho mayores que los de Sephadex. Debido a ello, es útil para el análisis o la separación de grandes proteínas globulares o grandes moléculas lineales como el ADN. 
El análisis de la electroforesis y su fotografía se realiza  a través del Gene Scan y utilizando un programa instalado al ordenador denominado Cuantity One el cual escanea y analiza todos los movimientos de las bandas de ADN, pudiéndose editar la fotografía con los contrastes adecuados para ver bien el avance de las bandas, además de imprimirlas, como se muestran más abajo en las figuras  1 y 2. 
Por la presencia de los grupos fosfato en los nucleótidos del ADN las moléculas se cargan negativamente y esto hace que la relación carga/masa sea constante. Esta propiedad permite separar los ácidos nucleicos mediante electroforesis sin necesidad de desnaturalización. (Ramos, 2001)
La cuantificación de ácidos nucleicos se realizó a partir de la  concentración de los fragmentos amplificados y purificados; y se cuantificó midiendo la densidad óptica a una absorbancia de 260 nm con NanoDrop® Spectrophotometer ND-100. Para este caso los valores deben ser mayores de 20 ng/μl. 
La  secuenciación de los microorganismos se realiza en el Laboratorio de Técnicas Instrumentales de la Universidad de León. Para la reacción de secuenciación se utiliza DYEnamic ET Dye Terminator kit (MegaBACE, Amersham). La amplificación se lleva a cabo en termociclador MJ Research PTC-200. Los fragmentos de ADN se analizan en un secuenciador MegaBACE 500. Las secuencias obtenidas se editan con Chromas v 1.45 (Conor Mc Carthy, 1996) y se realiza un BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) en la base de datos GnBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/) para establecer la especie con la que compartían mayor homología, considerando una identificación definitiva cuando los porcentajes de homología están comprendidos entre el 98 y el 100 %. 

 
RESULTADOS 
Hasta el momento se han logrado aislar 27 de hongos, distribuidas en diferentes fases. 
En la amplificación de las PCR se han visto resultados favorables. 
En las tablas 1y 2 se reflejan las muestras analizadas por cadáveres, fecha, proceso y los microorganismos fúngicos encontrados en ellas, se muestran los hongos identificados en cada fecha y reflejados en la fotografía de la electroforesis en las figuras 1,2 y 3.
La  primera fecha responde al día del montaje. Las muestras se denominaron con la "G" de gallinas, ejemplo G11/06.
 
PROCESO DE COMPOSTAJE EN GALLINAS 
Tabla 1: Muestras analizadas con los hongos encontrados en el compostaje de cadáveres de gallinas. 
Fecha toma de muestra
Microorganismos fúngicos
Especies encontradas
05-06-07
0
0
11-06-07
0
18-06-07
0
26-06-07
0
02-07-07
0
16-07-07
0
20-08-07
0
27-08-07
1
Cladosporium cladosporioides
04-09-07
0
 
10-09-07
2
Ascomycete sp, Thanatephorus cucumeris
17-09-07
2
Phaeosphaeria nodorum
24-09-07
4
Davidiella caciana, Uncultured endorphytic, Uncultured basidiomycete
Totales
9
 
 
 
PROCESO DE MADURACIÓN EN GALLINAS 
Tabla 2: Muestras analizadas con los hongos encontrados en la maduración del compostaje de cadáveres de gallinas. 
 
Fecha toma de muestra
Microorganismos fúngicos
Especies encontradas
24-09-07
4
Davidiella caciana, Uncultured endorphytic, Uncultured basidiomycete
04-10-07
5
Penicillium tricolor, Penicillium piceum, Ascomycete sp, Ceriporia lacerata, Eurotium amstelodami
Totales
9
 
 
La media de la temperatura externa (Te) e interna (Ti), se registró de la siguiente manera para cada ciclo y por cada proceso en el compostaje de gallinas, según se demuestra en la tabla 3:
Tabla 3: Media de las temperaturas externas e internas en el compostaje de residuos avícolas. 
 
CICLO
(Fechas)
Media temperatura externa 0C
Media temperatura interna 0C
PROCESO DE COMPOSTAJE DE GALLINA
11/06/07-26/06/07
24.18
54.25
02/07/07-16/07/07
26.6
43.83
20/08/07-27/08/07
29.71
57.14
PROCESO DE MADURACIÓN DEL  COMPOSTAJE DE GALLINA
04/09/07-24/09/07
26.54
41.45
 
Las medias de temperatura nos permiten tener una idea de la evaluación acertada de los microorganismos encontrados en cada ciclo y las condiciones en que se desarrollaron dentro del compostaje, para posteriormente evaluar su progreso en el exterior, lo cual nos da una idea de la permanencia o no, de sus esporas viables al exterior.
IDENTIFICACIÓN DE HONGOS 
Los hongos presentes en el proceso de descomposición y maduración, aparecen, siguiendo el orden de las muestras y representados en la fotografía del gel en la electroforesis como se muestra:

Identificación de hongos en el proceso de compostaje de cadáveres de aves y residuos avícolas - Image 1
 
De esta manera podemos observar que muchas de las muestras son representativas por la semejanza entre las especies encontradas en ellas. En la tabla 4 se puede ver las especies que coinciden en las muestras analizadas. En esta tabla todas las muestras pertenecen a la Granja de Villamuriel de Cerrato en Palencia.          
 Tabla 4: Especies de hongos  identificadas. 
 
Muestras
Especie
RB01
Ceriporia lacerata
RB02
Eurotium amstelodami
RB03, RB05
Cladosporium cladosporioides
RB04, RB09
Paecilomyces marquandii
RB06, RB12, RB17, RB27
Davidiella tassiana
RB07, RB13, RB23
Ascomycete sp
RB08
Thanatephorus cucumeris
RB10, RB11
Phaeosphaeria nodorum
RB14, RB15, RB26
Schizophyllum commune
RB16
Endorphytic sp
RB18
Basidiomycete sp
RB19
Penicillium tricolor
RB20, RB21
Penicillium piceum
RB22
Penicillium digitatum
 
 Por tanto se puede comentar que en esta investigación se pudo constatar las ventajas y desventajas de cada método de identificación, las cuales resumimos como se muestra:
I- MÉTODO TRADICIONAL: 
  • 1. Con el método tradicional la identificación se hace más engorrosa.
  • 2. Demora más tiempo debido a que depende de la disponibilidad, tiempo y destreza del investigador, hablamos de un día de trabajo para identificar 2 microorganismos aproximadamente.
  • 3. La identificación no se logra con la mayor exactitud en cuanto al % de semejanza, ya que se determina por la observación de la persona y no por un registro estadístico y automatizado para este fin.
  • 4. Esta metodología establece un % de error de identificación mayor a la realizada a través del ADN, ya que la semejanza se lograría hasta en un 92 %. (Sousa 2002). En este caso obtuvimos un 89 y 93 % de identificación, ya que solo se pudo constatar el género y no la especie debido a que se realiza por claves solo disponibles en libros, ésta no aparece en internet.
  • 5. Es menos costosa, ya que su proceso se encarece solamente hasta el momento de sembrar las muestras en el PDA, aunque luego su costo aumenta un poco en el tiempo y trabajo del investigador en el micro. Se podría hablar aproximadamente de hasta 21 euros por microorganismo.
 
II- MÉTODO POR SECUENCIACIÓN DEL ADN 
Con este método se facilitan mas las investigaciones y su rapidez en la identificación nos ahorra tiempo y trabajo. 
  • 1. El trabajo es más minucioso y aséptico.
  • 2. Los resultados se obtienen entre 3 y 5 horas solamente.
  • 3. Después de montar las PCR, purificar y secuenciar las muestras, el resultado es más seguro.
  • 4. Las identificaciones superan el 98 % de semejanza con el taxón requerido.
  • 5. La identificación es realizada a través de un sistema o registro de ADN computarizado y estadísticamente automatizado que podemos encontrar fácilmente desde cualquier ordenador o computadora con Internet en la web http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi .
  • 6. Se ahorra en tiempo, ya que en 3 horas se pueden secuenciar hasta 94 microorganismos, los cuales se identificarían en 5 minutos en el registro de ADN de estos, lo cual humaniza el trabajo del investigador.
  • 7. Su realización es mucho más costosa que la Tradicional, debido a los Kits, Primers y reactivos que se utilizan para este fin, aproximadamente unos 60 euros por microorganismo.
     
III- ESPECIES IDENTIFICADAS EN CADA MÉTODO DE UN TOTAL DE 13. 
IV- La metodología de extracción y secuenciación de ADN es la idónea para la identificación de hongos en cualquier tipo de compostaje, y en el suelo; obteniéndose resultados significativos y de muy buena calidad para la secuenciación e identificación de los mismos. 
V- Con la aplicación de este protocolo las muestras de ADN resultan muy limpias y con una lectura final de un alto % de probabilidad de semejanza con los existentes en el registro de microorganismos fúngicos. 

 

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Autores:
Msc. Reinel Brito Rodríguez
Universidad de Valladolid
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