Estandarización de la inmunofluoresencia para la detección del virus de PRRS

El Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (PRRS) es considerado la enfermedad más importante que afecta la producción del cerdo, causando grandes pérdidas económicas en todo el mundo. La alta variabilidad genética (15% y 12,5% entre los genotipos) del virus junto con la tasa de sustitución de nucleótidos (entre 4,7 × 10-2 y 1,55 × 10-3) y la recombinación, favorecidos por el comercio de animales afecta el control y el diagnóstico preciso de la enfermedad. El desarrollo y aplicación de pruebas de diagnóstico precisos juega un papel importante en los programas de vigilancia y control de la enfermedad. El objetivo de este estudio fue desarrollar y aplicar el ensayo de inmunofluorescencia (IFA) para el diagnóstico del virus de PRRS y de esta manera tener más herramientas disponibles para investigación y el diagnóstico.

 

Se cultivaron células MARC 145 en placas de 96 pozos a 37° C con 5% de CO2 durante 24 horas o hasta que se observó un 80-90% de confluencia. Las células fueron infectadas por cuadruplicado durante 96 horas con diferentes concentraciones de seis virus de campo provenientes de diferentes estados de la República Mexicana (Sonora, Jalisco, Guanajuato, Hidalgo, Michoacán, Estado de México). Las placas fueron lavadas tres veces con 100 µl de PBS estéril y se fijaron con 50 µl de acetona al 80%. El bloqueo se realizó con 200 µl de PBS-BSA durante 30 minutos a temperatura ambiente; se decantó y se añadieron 30 µl de anticuerpo fluorescente (Rural Technologies SDOW-F 1009282 para la proteína de la nucleocápside, ORF 7) probando diferentes diluciones de 1:10 hasta 1: 100 en PBS 5% BFS y se dejó incubar a 37 ° C. Finalmente se decantó y se lavó la placa tres veces con 100 µl de PBS a 4° C dejando 50 µl para observar la placa bajo el microscopio Life Technologies EVOS FL.

 

La fluorescencia se observó en todas las diluciones mientras que las células control negativo no mostraron ninguna fluorescencia. Las seis cepas muestran resultados positivos con fluorescencia observada con diferentes intensidades. El ensayo se estandarizó para la dilución 1: 100 para optimizar el reactivo. La IFA se estandarizó a una concentración de 1:100 del anticuerpo.

 

El diagnóstico se logró adecuadamente con la técnica de IFA utilizando reactivos comerciales para las seis cepas de virus utilizados, que son una muestra representativa de cepas endémicas que circulan en México. Es importante contar con técnicas de laboratorio para el diagnóstico de la enfermedad; específicamente en el caso del virus de PRRS, donde la variabilidad del virus produce un efecto citopático variable y en algunos casos difíciles de observar, lo que puede complicar la investigación y el diagnóstico. El uso de la IFA como prueba comprobatoria proporciona una herramienta más para el diagnóstico preciso.

 

1. Drigo M, et al. 2014. J Virol Methods; 202:79-86.

2. Nieuwenhuis N, et al. 2012. Vet Rec. 3;170(9):225.

3. Franzo G, et al. 2014. Virus Res. 19;194:159-66