Criopreservación de semen ovino empleando tres dilutores y cuatro combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes

Los resultados de la inseminación artificial con semen congelado resultan hasta ahora insatisfactorios en ovinos. La fertilidad obtenida con semen congelado es menor a la de semen fresco, debido principalmente a una baja viabilidad post-descongelamiento y a un trastorno subletal en la proporción de espermatozoides sobrevivientes (Watson, 2000). Esto se debe a los daños ocasionados en la membrana del espermatozoide durante el proceso de criopreservación, donde se altera la función metabólica del espermatozoide, reduciendo así el número de células viables y ocasionando una capacitación espermática prematura (Maxwell y Watson, 1996). Consecuentemente, los espermatozoides sólo serían viables un corto periodo de tiempo en el tracto reproductivo de la hembra y, por lo tanto, tendrían una menor oportunidad de poder fecundar los ovocitos (Gillan y Maxwell, 1999).

Los daños producidos en los espermatozoide durante el proceso de criopreservación podrían ser prevenidos parcialmente controlando la velocidad de congelamiento, usando un dilutor adecuado y agregando agentes crioprotectores apropiados. En la criopreservación de semen ovino, se ha venido evaluando diferentes tipos de dilutores y agentes crioprotectores (permeantes y no permeantes) obteniéndose resultados muy variables (Molinia et al., 1994 a,b; Gil et al., 2000; Salamon y Maxwell, 2000).

Los crioprotectores permeantes son sustancias que por su bajo peso molecular pueden atravesar la membrana plasmática, donde tienen la función de evitar la formación intracelular de cristales de hielo, así como evitar la excesiva deshidratación causada por la congelación lenta (Medeiros et al., 2002). Entre los más utilizados está el glicerol y el etilenglicol, siendo el primero el que ha mostrado mejores resultados en estudios de criopreservación de semen ovino en relación a la motilidad progresiva post-descongelamiento (Salamon y Maxwell, 2000). No obstante, el etilenglicol ha mostrado un efecto similar o mejor que el glicerol en otras especies (Mantovani et al., 2002). Por otro lado, los crioprotectores no permeantes son sustancias que por su alto peso molecular resultan útiles cuando se aplican velocidades rápidas de congelación, ya que la acción crioprotectora está asociada con su actividad deshidratante y su interacción específica con la membrana fosfolipídica (Aisen et al., 2000). Éstos suelen usarse en asociación con los agentes crioprotectores permeantes. Los crioprotectores no permeantes más utilizados para la congelación de semen de diferentes especies son la sacarosa, rafinosa, trehalosa y lactosa. La adición de trehalosa y sacarosa al dilutor ha obtenido buenos resultados en la criopreservación de semen ovino (Molinia et al., 1994b; Aisen et al., 2000).

El estudio se desarrolló en dos fases. La primera fase permitió identificar y seleccionar entre tres dilutores, el que sería incorporado en los tratamientos de la segunda fase del estudio. En esta última, se evaluó cuatro combinaciones de dos agentes crioprotectores permeantes y dos no permeantes.

El trabajo se ejecutó en el Laboratorio de Reproducción Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos (FMV-UNMSM). Se utilizaron 2 machos ovinos adultos de la raza Merino y 2 Pelibuey, de 2 a 3 años de edad. Las colecciones de semen se realizaron semanalmente en el establo de la FMV-UNMSM, utilizando una vagina artificial de ovino.

Se evaluaron tres tratamientos:

Se realizaron seis ensayos, empleándose una muestra resultante de cuatro eyaculados en cada ensayo. Se evaluó el efecto de cada dilutor sobre los porcentajes de motilidad progresiva y de espermatozoides vivos con acrosoma intacto post-descongelamiento.

Se empleó como dilutor el que obtuvo los mejores resultados en el Exp. 1. Los tratamientos consistieron en las combinaciones de agentes crioprotectores permeantes y no permeantes: 1) Glicerol-Trehalosa, 2) Glicerol-Sacarosa, 3) Etilenglicol-Trehalosa y 4) Etilenglicol-Sacarosa. Se realizaron ocho ensayos. Se evaluó el efecto de los tratamientos sobre los porcentajes de motilidad progresiva y de espermatozoides vivos con acrosoma intacto post-descongelamiento, termoresistencia y de espermatozoides con membrana plasmática íntegra.

Se trabajó únicamente con las muestras de semen que tuvieron un volumen >0.8 mL, motilidad masal >3 y una concentración >1000 x 10⁶ de espermatozoides por mL. Los cuatro eyaculados se mezclaron formando un pool de semen.

El enfriamiento del semen comprendió 2 fases: en la primera, se diluyó el semen con la primera fracción del dilutor a 35 ºC, luego se disminuyó la temperatura hasta llegar a los 5 ºC en un lapso de 90 minutos. En la segunda fase se agregó la segunda fracción del dilutor (sustancias crioprotectoras), y se incubó a 5 ºC durante 30 minutos para estabilizar la muestra (Salamon y Maxwell, 2000). Luego, las muestras fueron envasadas en pajillas de 0.5 mL. A continuación, las pajillas fueron congeladas con los vapores de nitrógeno líquido; para tal efecto, se disminuyó la temperatura de 5 a -25 °C en un lapso de 6 minutos y finalmente fueron sumergidas en nitrógeno líquido (-196 ºC) (Byrne et al., 2000).

En el Exp. 1, se evaluó la motilidad progresiva y la viabilidad e integridad acrosomal, mientras que en el Exp. 2, se evaluó; además, la integridad de la membrana plasmática y la termoresistencia. El descongelamiento se realizó sumergiendo las pajillas en agua temperada a 37 °C por 10 segundos. Luego, el semen fue diluido (1:10) con una solución base isotónica (27.1 g de Tris, 14.0 g de ácido cítrico, 10.0 g de fructosa y agua bidestilada csp. 1,000 mL) temperada a 37 ºC. Luego de 20 minutos se procedió a la evaluación.

Análisis Estadístico 

Se empleó el programa estadístico Prism® v. 3.0. Se empleó el análisis de varianza (ANOVA), para determinar diferencias estadísticas entre tratamientos, y la prueba de Tukey para determinar diferencias entre promedios. Previamente, todos los resultados fueron transformados a valores angulares (ángulo = arcoseno √ x ) para acercar los datos a la distribución normal.

Con la finalidad de uniformizar los valores iniciales del semen fresco de cada ensayo, los resultados se expresaron como las proporciones entre los valores inmediatamente descongelados con los valores del semen fresco.

Los resultados se muestran en el Cuadro 1. Se puede observar que el dilutor A obtuvo los mayores porcentajes de espermatozoides vivos con acrosoma intacto y de espermatozoides con motilidad progresiva (p<0.05). Los resultados demuestran que los dilutores que contenían Tris (A y B), tuvieron una mejor capacidad de amortiguación, de regulación osmótica y baja toxicidad en comparación con el dilutor que contenía leche descremada (C).

Las diferencias encontradas entre A y B pueden deberse a las diferencias entre las concentraciones de Tris empleadas por cada dilutor (224 versus 150 mM, para A y B, respectivamente). En contraste, Molinia et al. (1994b) encontraron una mejor motilidad progresiva con 150 mM de Tris, cuando compararon diferentes concentraciones (100 a 300 mM). Sin embargo, los resultados encontrados por Molinia et al. (1994a) son inferiores a los reportados por Aisen et al. (2000), quienes utilizaron un dilutor de las mismas características del Dilutor A. Las diferencias en las concentraciones de ácido cítrico y fructosa entre los dilutores A y B, por la necesidad de regular el pH y la osmoralidad de dichos dilutores, podrían explicar en parte las tendencias observadas entre ambos.

Los resultados obtenidos con el Dilutor C son diferentes a otros estudios donde no se emplearon crioprotectores no permeantes. Así Gil et al. (2000), al emplear un medio en base a leche descremada, obtuvieron valores de motilidad progresiva superiores en comparación a un dilutor en base a Tris. Este hecho, presumiblemente se debe a que en el presente estudio se empleó un crioprotector no permeante (Trehalosa). Esto corrobora que los altos niveles de calcio presente en la leche pueden afectar negativamente la acción crioprotectora de la Trehalosa (Foote et al., 1993), lo que alteraría la estabilidad de las membranas de los espermatozoides durante el congelamiento.

En este experimento se utilizó el Dilutor A como dilutor base, dado que resultó ser significativamente mejor que los otros dos dilutores. Los resultados se resumen en el Cuadro 2. Se puede apreciar que, independientemente del tipo de crioprotector no permeante empleado, la calidad del semen post-descongelamiento fue significativamente mejor en los grupos que utilizaron glicerol como crioprotector permeante. Por otro lado, no se observó diferencias significativas entre los grupos glicerol-trehalosa versus glicerol-sacarosa, ni etileglicol-trehalosa versus etilenglicol-sacarosa.

La ventaja del uso del glicerol sobre el etilenglicol como crioprotector permeante, en la prevención de la pérdida de la motilidad progresiva post-descongelamiento en semen de ovinos ha sido corroborada en otros estudios (Molinia et al., 1994a). Asimismo, en semen caprino se ha encontrado una mejor motilidad progresiva con glicerol en comparación con etilenglicol (Bittencourt et al., 2004). Sin embargo, en protocolos de criopreservación de semen de otras especies, como humanos (Gilmore et al, 2000), equinos (Mantovani et al., 2002) y bovinos (Guthrie et al., 2002), se ha encontrado mejores resultados al usar etilenglicol.

La reducción de la capacidad fecundante del semen criopreservado no sólo se debe a una disminución de la viabilidad espermática, sino además, a los trastornos subletales que experimentan los espermatozoides sobrevivientes (Watson, 2000), de allí la importancia de evaluar la viabilidad e integridad acrosomal, ya que es un indicativo aproximado de la real capacidad fecundante que poseen los espermatozoides post-descongelamiento. En tal sentido, el semen que fue criopreservado con glicerol (más trehalosa o sacarosa), tuvo una mayor proporción de espermatozoides vivos con acrosoma intacto en comparación con el semen criopreservado con etilenglicol (más trehalosa o sacarosa) (p<0.05, Cuadro 2).

De la misma manera, los agentes crioprotectores permeantes empleados en este estudio influyeron significativamente sobre la integridad de membrana plasmática. Se obtuvo un mayor porcentaje de espermatozoides con membrana plasmática íntegra cuando se utilizó glicerol en comparación con etilenglicol. Este parámetro es un indicativo de la funcionabilidad fisiológica de las membranas espermáticas. La alteración en la capacidad de regular el flujo de iones y agua por la membrana plasmática de los espermatozoides, produciría cambios relacionados con la capacitación prematura y la exocitosis acrosomal (Sanocka y Kurpisz, 2004).

Las ventajas de la capacidad crioprotectora del glicerol sobre el etilenglicol en espermatozoides ovinos podría deberse a una mayor susceptibilidad de los espermatozoides ovinos a los efectos tóxicos que podrían tener las altas concentraciones de etilenglicol; por lo tanto, sería conveniente probar el etilenglicol a una menor concentración a la usada en el presente trabajo (2.25%).

Los crioprotectores no permeantes (trehalosa y sacarosa), no mostraron diferencia significativa en lo concerniente a la motilidad, viabilidad e integridad acrosomal, integridad de membrana y termoresistencia; hecho que coincide con otros reportes, en los cuales se demuestra que protegen a las células espermáticas del efecto de la criopreservación (Aisen et al., 1990). En ese sentido, Aisen et al. (2000) encontraron que la adición de trehalosa en un dilutor en base de Tris mejoró la motilidad progresiva en un 19%.

La trehalosa es un protector específico de las membranas espermáticas que, como resultado de su interacción con los fosfolípidos, puede unirse con el hidrógeno de las cabezas fosfolipídicas de la membrana, de una manera mas fuerte que el glicerol (Foote et al., 1993). Además, posee una acción crioprotectora relacionada al efecto osmótico, que protege al espermatozoide del congelamiento (Aisen et al., 2002).

Los resultados del presente experimento demuestran que la sacarosa tiene las mismas cualidades de protección que la trehalosa en el espermatozoide ovino durante el proceso de criopreservación. Esto se corrobora con otros estudios, donde no existe diferencia entre el tipo de azúcar (sacarosa, trehalosa) utilizado en el diluyente sobre la motilidad post-descongelamiento de espermatozoides ovinos (Molinia et al., 1994b). Adicionalmente, Aisen et al. (1995) manifiestan que la trehalosa posee una capacidad protectora específica de la membrana que no poseen otros disacáridos como la lactosa.

El presente trabajo es importante para una mejor comprensión del desempeño de los dilutores y agentes crioprotectores en la criopreservación de semen ovino; sin embargo, aún se requieren otros estudios para mejorar la capacidad fecundante del semen criopreservado. Se concluye que un dilutor con las características del dilutor A, utilizando glicerol más trehalosa o sacarosa, constituye una buena alternativa para la criopreservación de semen ovino.

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