Aflatoxinas Totales en Queso

Para la determinación de aflatoxinas totales en quesos por método ELISA, depende en parte del protocolo correspondiente a cada marca comercial. Puedes seguir el siguiente método: -Pesar 2 g de queso, agregar 40 mL de diclorometano. Extraer durante 15 minutos en un agitador a 260 rpm a temperatura ambiente. Tomar 10 mL del extracto y evaporar a 60 C en un evaporador, o en corriente de nitrógeno. Redisolver el residuo en una mezcla de 0,5 mL de PBS, 0,5 mL de metanol y 1 mL de hexanos. - Tomar 0,5 mL de la porción acuosa (capa inferior) y diluir con 2 mL de metanol al 70 (dilución 1:5). Y está listo para usar en el kit ELISA. El factor de dilución que debes usar para el cálculo final de la concentración de toxinas en tu muestra es 10.

Muchas gracias por su ayuda. El Kit Elisa es de la casa r-biopharm, ¿tienes alguna experiencia en su uso?

No personalmente, solo trabajamos con kits de Romer Labs, y este protocolo lo aplicamos con ese kit.

Estimada Isabel, como sabrá el 60 de la aflatoxina M1 que puede contaminar la leche va al queso. Así pues, es muy importante el análisis concreto de esa micotoxina en el queso. Para ello le aconsejo que utilice, si le es posible, la técnica que le indico: DRAGACCI, S. GLEIZES, E. FREMY, J.M. CANDLISH, A.A. (1995). “Use of immunoaffinity chromatography as a purification step for the determination of aflatoxin M1 in cheeses”. Food Additives and Contaminants, 12: 59-65 and CNEVA 1994. En esa técnica, la extracción se hace también con diclorometano y luego una fase de limpieza con columna de inmunoafinidad. Lo más importante pues es que esa técnica utiliza las columnas de inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales especificos en ese caso de la aflatoxina M1, a diferencia de los métodos basados en “Elisa” que utilizan anticuerpos policlonales inespecificos. Posterior al uso de la columna de inmunoafinidad, la tecnica anteriormente referida, utiliza HPLC. En general y cuando se trabaja con métodos basados en “Elisa” le aconsejo que todos los resultados que sean positivos, los reconfirme por la técnica anteriormente referida, visto que con “Elisa” corre el riesgo de obtener “falsos positivos” o bien una concentración más elevada de la micotoxina de la que en realidad existe. Un saludo.

La ocurrencia de aflatoxinas M1 en quesos, por la elaboración de los mismos con leche contaminada con este metabolito es un punto muy importante a tener en cuenta, y estoy de acuerdo con el Dr. Jimeno, pero no es raro encontrar además, e incluso diría que es más frecuente el hallazgo, en quesos de pasta semi-dura y dura, niveles significativos de otras toxinas, como ser el caso de aflatoxinas, citrininas, acido ciclopiazónico e incluso ocratoxinas, por eso es también de suma importancia evaluar estas toxinas en los quesos, así como la pureza de los starters que se incoculan para maduración y refinado del queso, e incluso, hacer un control de las cepas ambientales de las cámaras de maduración. Con respecto a la utilización o no de las pruebas ELISA, primero hay que evaluar la calidad del kit comercial que se está utilizando, en este momento, y a diferencia de los primeros kits que se encontraban en el mercado, es muy común la utilización de anticuerpos monoclonales para la elaboración de los kits, y esto puede observarse con los resultados de validaciones de las pruebas de los kits vs. HPLC, entonces es de considerar que los errores que se podrían tener con un kit ELISA con anticuerpos monoclonales serían dimensionalmente similares a los que pueden ocurrir al utilizar una columna de inmunoafinidad con anticuerpos monoclonales. Lo que definirá la sensibilidad del método, así como la exactitud, serán el tipo de Patrones que se utilicen para la comparación, tanto en HPLC como en ELISA, como las características del instrumento con el cual se llevará a cabo la lectura (tanto el lector ELISA como el Cromatógrafo). En síntesis, si se compara un sistema con otro fundamentando la diferencia en el tipo de anticuerpos que se utilice para la manufactura de una IAC o de un kit ELISA, podemos obtener resultados similares cuando se trabaja con anticuerpos monoclonales (disponibles ambos sistemas en el mercado), es decir que en este punto no habría diferencia. De todas maneras, los sistemas cromatográficos siguen siendo los métodos de referencia, por lo tanto en caso de discrepancias o disputas, estos son los sistemas que deben utilizarse para un control, pero los kits ELISA permiten tener resultados rápidos a ser utilizados en las industrias que muchas veces en sus laboratorios de control interno no cuentan con cromatógrafos.

Estimada Patricia, respecto al primer párrafo de su comentario, le diré que yo solo me referí a un miembro de la familia de las aflatoxinas (aflatoxina M1) visto que el interés para Isabel era solo lo que se refiere a las aflatoxinas y en lo general ya estaba explicado por UD. Respecto a contaminaciones con otras micotoxinas estoy de acuerdo con lo que dice e incluso se debe añadir otra en la lista de posibles contaminaciones en el queso como es el caso de la sterigmatocistina producida entre otros por algunas estirpes de Aspergillus versicolor que invade con frecuencia los quesos. Respecto a lo de “Elisa” y existiendo en el mercado kits de “Elisa” que trabajan con anticuerpos monoclonales tal como UD refiere, en ese caso estoy perfectamente de acuerdo con sus comentarios, sin embargo y para no haber confusiones hay que aclarar muy bien, a las personas interesadas, cuales son esos kits y que características tienen visto que continúan existiendo en el mercado muchos kits “Elisa” con los clásicos anticuerpo policlonales. Sus comentarios y observaciones al respecto pueden ser muy útiles para quienes están utilizando de una forma sistemática lo métodos basados en “Elisa” Un saludo Alberto Gimeno

Reciban un cordial saludo. Si yo uso un kit de alta sensibilidad para detección de aflatoxinas totales de un kit Neogen que usualmente uso en productos como maíz, etc. Podría yo correr una muestra de queso, extrayéndolo con metanol al 70, y mezclándolo x 2 minutos a 26o rpm, luego filtro y al resultado del filtrado, corro el kit? Yo tengo entendido que con los métodos Elisa pueden existir problemas con muestras que tengan color (en este caso blanquecino). Cabe indicar que he corrido muestras con uvas pasas, y lo resultados los he comparado con HPLC, y son prácticamente iguales. ¿Puedo usar la extracción simple mencionada, para analizar aflatoxinas? Gracias.