Utilización de un protocolo con proestro prolongado con y sin ECG en vacas lecheras holstein en la Amazonía ecuatoriana

El anestro posparto en vacas es uno de los factores que afecta negativamente el desempeño reproductivo en el trópico (Guáqueta et al., 2014). La corta duración del estro y la tendencia a mostrar el celo durante la noche, afectan en gran medida la eficiencia de los programas de inseminación artificial en ganado Bos indicus manejados en áreas tropicales (Baruselli et al., 2004).

El protocolo a base de estradiol y progesterona (P4) llamado J-Synch se ha perfeccionado con el objetivo de aportar un proestro prolongado, mejorando el desarrollo del folículo dominante preovulatorio, e incrementando la tasa de preñez después de la Inseminación Artificial a Tiempo Fijo (IATF) en vaquillonas para carne (De la Mata y Bó, 2012) y para leche (Ré et al., 2018). La importancia de un proestro prolongado se generó luego de una serie de estudios que valoraron la influencia de la madurez folicular sobre la fecundidad en ganado vacuno (Day, 2015; Bridges et al., 2008; Menchaca et al., 2017 ) a su vez está demostrado que existe una alta incidencia de muerte embrionaria durante las primeras tres semanas después de la fertilización y que los primeros estadios de embrión hasta la etapa de concepto depende exclusivamente de las secreciones (histótrofo) del útero y oviductos (Binelli et al., 2017; Menchaca et al., 2017). Al comparar vacas que recibieron estradiol exógeno (Ciprionato de estradiol y Benzoato de estradiol) en el periodo preovulatorio, con las que no lo recibieron, se demostró que niveles más altos de estradiol en sangre en dicho período, correspondieron con menores pérdidas embrionarias en la etapa entre el reconocimiento materno de la gestación y la implantación (Madsen et al., 2015; Menchaca et al., 2017).

Baruselli et al. (2004), han demostrado que el uso de gonadotrofina coriónica equina (eCG) crea condiciones para estimular el crecimiento folicular y la ovulación, incluso en vacas que tengan problemas con la liberación de gonadotropina. Su uso ha presentado efecto positivo en vacas con baja tasa de ciclicidad (anestro), en animales recién paridos (período pos-parto inferior a 60 días), en animales que presentan baja condición corporal y que presentan comprometido el crecimiento del folículo dominante. Garnica, (2012) mostró resultados de la investigación, en la cual evaluó el efecto de la eCG sobre el desarrollo folicular y la ovulación en vacas Holstein posparto. Este trabajo concluyó en que la eCG no mejoró el diámetro del folículo dominante, pero si la tasa de ovulación. Por otro lado, Ortiz et al. (2017) trabajaron con vacas lecheras Holstein mestizas manejadas en la Amazonía y mostraron el efecto de la eCG sobre el tamaño del folículo preovulatorio, cuerpo lúteo en el día 7, día 20 pos IATF y la tasa de preñez, se encontró que a los 20 días pos inseminación existe diferencia significativa con mayor tamaño del cuerpo lúteo cuando se administra dos dosis de eCG (una previa a la ovulación y la otra a los 14 días de la IATF) con un 60 % de preñez.

Con los resultados obtenidos a la aplicación del protocolo J-Synch, Bo et al. (2018) propusieron que las vaquillonas que manifiestan celo antes de las 60 horas de retirado el dispositivo intravaginal, podrían ser inseminadas antes sin afectar la preñez, pero que sería necesario determinar el tiempo óptimo para la IATF en aquellos que no mostrarían celo. La incorporación de protocolos con proestro prolongado en condiciones extremas, ha permitido mejorar los porcentajes de concepción tanto en vacas lecheras, anéstricas y con períodos abiertos extensos en climas tropicales. Sin embargo, el protocolo J-Synch aún es necesario seguir validándolo en otras condiciones ambientales (Amazonía Ecuatoriana). Así, el objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto de la eCG sobre la expresión de celo, el momento de la ovulación, diámetro del folículo preovulatorio y tasa de preñez en vacas Holstein tratadas con un protocolo de proestro prolongado.

Esta investigación se realizó en la Provincia de Pastaza - Ecuador, desde octubre del 2018 a octubre del 2019. Presenta una precipitación fluvial de 4000 a 5000 mm/ año, el clima es cálido y húmedo con una temperatura que varía entre los 18 y 24°C. Además, cuenta con una topografía irregular, fincas con un área promedio de 50 ha, conformadas por pastizales propios de la zona (Gramalote; Axonopus scoparius), y pequeñas parcelas agrícolas (González Marcillo et al., 1997).

Se utilizaron 306 vacas en producción con cría al pie, de la raza Holstein, alimentadas mediante un sistema de pastoreo al sogueo (Carrera Durazno et al., 2015) con una producción promedio de 8±1,5 litros de leche por vaca/día en un solo ordeño, con 90 a 150 días de paridas, multíparas con una edad de entre 34 y 65 meses, condición corporal de 2.5 a 3 (escala 1 al 5) (Edmonson y Lean,1989) y con un peso vivo de entre 400 y 450 Kg.

Se utilizó el protocolo de sincronización de celos con proestro prolongado denominado J-Synch (de la Mata et al., 2012) al cual se modifica adicionando eCG y realizando la IATF a las 60 y 72 horas de retirado el dispositivo intravaginal. Para lo cual al total de vacas se dividió aleatoriamente en dos grupos: Grupo 1 con adición de eCG y Grupo 2 sin eCG. A su vez estos dos grupos se subdividieron en dos grupos más, uno que se realiza IATF a las 60 horas y otro la IATF a las 72 horas de haber retirado el dispositivo intravaginal. Esquemáticamente representado.

T1: J - Synch + eCG + Celo - IA 60 horas (n=92)

T2: J - Synch + eCG + Sin Celo + GnRH - IATF 72 horas (n=61)

T3: J - Synch + Celo – IA 60 horas (n=70)

T4: J - Synch+ Sin Celo + GnRH - IATF 72 Horas (n=83)

La distribución de los tratamientos (T) fue completamente al azar, en cada uno se reali-zaron cuatro repeticiones (T1: 23, 23, 23 y 23 (92), T2: 16, 15, 15 y 15 (61), T3: 18, 18, 17 y 17 (70) T4: 21, 21, 21 y 20 (83) vacas con cada uno de los tratamientos).

Para el desarrollo de la investigación, en el día 0 a cada una las 306 vacas se realizó una primera evaluación reproductiva mediante ultrasonografía para analizar el estatus ovárico y que todos los animales cumplan con los parámetros propuestos para poder ser incluidas en la presente investigación, adicionalmente se le colocó un dispositivo intravaginal con progesterona (DIB 0.5 gr) más la aplicación de 2 mg de BE por vía IM; al día 6 las vacas se dividen en grupos según los tratamientos así:

TRATAMIENTO 1 (T1): al día seis, a las vacas se les retiró eldispositivo intravaginal con progesterona, y se les administró PGF2α (500μg de Cloprostenol), más eCG 400 U.I, se realizó una medición mediante ultrasonografía para determinar el desarrollo folicular, se aplicó un marcador de pintura en la base de la cola para observar la presencia o ausencia de celo el mismo que se efectuó tres veces por día (en la mañana, medio día y tarde), las vacas que presentaron celo hasta que se cumplieron las 60 horas desde que se retiró el dispositivo se inseminaron artificialmente en ese tiempo, además que se realizó ultrasonografía para determinar el diámetro del folículo preovulatorio.

TRATAMIENTO 2 (T2): Del grupo de vacas del (T1) que no hanpresentado celo hasta las 60 horas de retirado el dispositivo intravaginal, se las realizó ultrasonografía para valorar el diámetro del folículo dominante y al día 9 (72 horas después de retirado el dispositivo intravaginal) se efectuó la IATF con la aplicación al mismo tiempo de GnRH (2.5 ml/vaca), de la misma manera se continua con la medición del folículo preovulatorio con ultrasonografía para ver el comportamiento de los mismos con un proestro prolongado.

TRATAMIENTO 3 (T3): al día seis, se le retiró el dispositivointravaginal con progesterona, se administró PGF2α (500μg de Cloprostenol) y a este grupo no se aplicó eCG, seguidamente se realizó una medición mediante ultrasonografía para determinar el desarrollo folicular, se aplicó un marcador de pintura en la base de la cola para observar la presencia o ausencia de celo, se efectuó tres veces por día (en la mañana, medio día y tarde), las vacas que presentaron celo hasta que se cumplió las 60 horas desde que se retiró el dispositivo intravaginal se inseminaron artificialmente en este tiempo, además que se realizó ultrasonografía para determinar el diámetro del folículo preovulatorio.

TRATAMIENTO 4 (T4): Del grupo de vacas del (T3) que nopresentaron celo, hasta las 60 horas de retirado el dispositivo intravaginal, se las realizó ultrasonografía para valorar el diámetro del folículo dominante y al día 9 (72 horas después de retirado el dispositivo intravaginal) se efectuó la IATF con la aplicación al mismo tiempo de GnRH (2.5 ml/vaca), de la misma manera se continua con la medición del folículo preovulatorio con ultrasonografía para ver el comportamiento de los mismos con un proestro prolongado.

Para la IATF se utilizó semen congelado/descongelado utilizando la técnica descripta por Bernardi et al. (2011), de un solo toro, de fertilidad probada, aunque igualmente antes de utilizarlo se analizó y fueron inseminadas por un mismo técnico.

Los celos fueron observados a partir de las 24 horas después del retiro del dispositivo intravaginal (por la mañana, medio día y tarde) de los días 7, 8 y 9; considerando vaca en estro, por medio de pérdida de la pintura de la base de la cola y presencia de flujo vaginal cristalino (clara de huevo) en momentos previos a la ecografía e IATF.

Para evaluar el desarrollo folicular se usó ultrasonografía, en el día seis al retiro del dispositivo intravaginal bovino de progesterona, al momento de la IATF (60 y 72 horas de retirado el implante intravaginal de progesterona) con la finalidad de realizar un seguimiento a la dinámica folicular y al finalizar el estro. También, al día siete, post – inseminación se midió a través de ecografía el tamaño de cuerpo lúteo, para ello siempre se tomaron dos medidas (alto – ancho en mm) de cada estructura (cuerpo lúteo o folículo) y se promedió entre ambas para obtener una medida más aproximada (Kastelic et al., 1990).

Para determinar el momento de la ovulación (desaparición del folículo de mayor diámetro) se continuó evaluando mediante ultrasonografía el desarrollo folicular esto se hizo en un grupo menor de animales (T1 y T2 = 26; T3 y T4= 18, esto se debió a las dificultades para acceder o permanecer en diferentes horarios en los establecimientos privados utilizados), para ello se realizó una ecografía a 12 horas posterior de la IATF, luego a los animales que aún no habían registrado ovulación se realizó otra ultrasonografía a las 24 horas y a los animales que aún no habían ovulado hasta esta instancia se determinó subjetivamente que ovularon > 24 horas posteriores a la IATF lo que se reconfirmó con la presencia del CL a los 7 días pos IATF.

El diagnóstico de gestación se determinó por medio de ultrasonografía a los 35 a 40 días posterior a la IATF ((Ibex Pro and Lyte ®, USA, with a linear probe of 5.0 MHz)

En la realización de este estudio se analizaron las siguientes variables:

Para cada variable estudiada se estimaron la media aritmética y el error estándar (EE). Se probó si existían diferencias significativas entre los tratamientos mediante la aplicación de análisis de la variancia (ANOVA) a un criterio de clasificación y pruebas de comparaciones múltiples de Tukey-Kramer HSD (P≤0,05). Los análisis estadísticos fueron realizados utilizando el programa JMP program Statistical Discovery From SAS (JMP ®, 2003) in its version 5.0 for Windows.

Sin tener en cuenta los tratamientos utilizados de las 306 vacas inseminadas, 155 vacas se preñaron representando el 50.7% y 151 vacas resultaron vacías el 49.3 %.

En la Tabla 2 se muestra la tasa de preñez de los protocolos T1, T2, T3 y T4. Aunque no son significativos, se observa una atendencia de una mejor tasa de preñez de los protocolos T1 y T2.

Existió un 52.3% (162/306) de presencia de celo del total de animales para ambos tratamientos con o sin eCG.

De las vacas que manifestaron celo, la tasa de preñez en las vacas del grupo J-Synch con eCG y IATF a las 60 horas fue del 59.8% (55/92) vs las sin eCG 47.1% (33/70; P>0.05). Así mismo las vacas sin presencia de celo y que recibieron IATF a las 72 horas la tasa de preñez fue del 48.5% (33/68) para las con eCG y 41.0% (34/83) para las sin eCG (P>0.05).

El tamaño del folículo al retiro del dispositivo de progesterona no difirió entre los tratamientos (P≥0,05), aunque si se encontraron diferencias significativas (P≤0,05) al momento de la inseminación artificial.

El intervalo medio de ovulación desde la remoción del dispositivo no fue significativamente diferente (P≥0.05) para los cuatro tratamientos T1: 106 ± 1.8; T2: 108 ± 2; T3: 114 ± 2.3 y T4: 114 ± 2.3 horas.

Tamaño del cuerpo lúteo a los siete días post inseminación.

El diámetro cuerpo lúteo medido al día 7, difirió significativamente entre tratamiento (p≤0,001) (T1: 20.5±0.2 mm; T2: 20.7±0.2 mm; T3: 18.3±0.6 mm y T4: 19.2±0.4 mm).

En la Figura 6 se observa la combinación de las horas hasta la ovulación de cada tratamiento, el diámetro del cuerpo lúteo y el porcentaje de preñez. Notando que el T1 posee la menor cantidad de horas a la ovulación y el porcentaje de preñez mayor.

El tratamiento J-Synch con eCG presentó en este estudio en vacas para leche en la Amazonía Ecuatoriana una tasa de concepción del 57.5% de preñez y un 43.8 % de preñez el tratamiento J-Synch sin eCG. No existen investigaciones similares en la zona, sin embargo los datos hallados se podrían contrastar con los encontrados por Ortiz et al. (2017) en donde un estudio con protocolo convencional más eCG en vacas lecheras el porcentaje de preñez no superó el 47.5%; de la misma manera estudios realizados en la Amazonía con protocolo de proestro prolongado pero en vacas doble propósito llevado a cabo por Yánez et al. (2018) y López, (2017) obtuvieron valores diferentes en la tasa de preñez 61 y 59.4% respectivamente.

En otra zona del país, específicamente en la sierra ecuatoriana, un estudio realizado por Ruiz, (2017), con protocolo J-Synch en vacas lecheras sin eCG presentó valores de 37.5 % de preñez, valor por debajo del encontrado en este trabajo. Ré et al. (2018) en un estudio utilizando el tratamiento J-Synch en vaquillonas lecheras encontraron un 63.6% de preñez. Resultados similares mostraron Menchaca et al. (2017) donde revelaron que es posible aplicar el protocolo J-Synch en vacas con anestro posparto y destete precoz, y obtener resultados aceptables en tasa de preñez (62.5%) realizando la IATF entre las 60 y 72 horas con respuestas similares entre ambos momentos del servicio. Lo que se puede observar, teniendo en cuenta los lugares y protocolos, es que existe un rango de tasa de preñez que ronde cerca del óptimo biológico del 50%, a excepción del trabajo de la sierra ecuatoriana.

En relación con la expresión del celo se visualiza que el 59% de vacas sometidas al protocolo J-Synch con eCG presentan celo, por el contrario, para el tratamiento J-Synch sin eCG el 45.7% de vacas presentan celo, dichos datos contrastan con los reportados por Yánez et al, (2018) quién reporta datos en vacas Brown Swiss con protocolo J-Synch con eCG en la Amazonía que el 70.8% de las vacas presentaron celo. Y a su vez estos datos contrastan con los reportados por López (2017) quién muestra que el 78.2% de vacas Pardo Suizo mestizas presentan celo al ser tratadas con el protocolo J-Synch en la Amazonía con un régimen alimenticio en pastoreo libre. Más allá, que los trabajos comparados son con diferentes razas, aunque realizados en el mismo ambiente; una de las explicaciones del bajo porcentaje de expresión del celo en las vacas lecheras podría ser que particularmente estas vacas al estar atadas individualmente en espacios reducidos, no pueden expresar los síntomas previos del inicio del celo (grupo sexualmente activo), como es el roce y juego entre las vacas tratadas, no pueden montarse entre ellas, por consiguiente la detección del celo se reduce a la observación subjetiva por parte del vaquero de otros síntomas menos expresivos. No obstante, resultados diferentes presentó Tschopp, (2016) de un experimento evaluando el efecto de la expresión de celos y la adición de GnRH sobre la tasa preñez en vacas Holando en lactancia sincronizadas con estradiol y dispositivos con progesterona, así del total de animales, el 62.0% presentó celo dentro de las 48 horas de retirado el dispositivo intravaginal. Datos numéricamente inferiores a los reportados en la Amazonía presentó Mendes (2018) quien trabajó con vaquillonas tipo carne evaluando el protocolo J-Synch normal y un J-Synch modificado en un segundo grupo. Al analizar la expresión de celo a las 66 horas de retirado los dispositivos no se encontraron diferencias significativas entre los grupos. Se observó que las vaquillonas del Grupo J-Synch normal 45/129 (35%) mostraron celo y fueron insemina-das en ese mismo momento, mientras que las vaquillonas del Grupo J-Synch modificado lo hicieron 108/128 (84%; P≥0,05). Al Día 9, se observaron 19 vaquillonas más en celo del Grupo J-Synch normal, logrando un 49% de celo (64/129) acumulado; mientras que 12 vaquillonas del Grupo J-Synch modificado entraron en celo logrando un 93% de celo (120/128) acumulado.

La dinámica folicular del presente estudio detalló que el tamaño del folículo al retiro del dispositivo de progesterona (día 6) no mostró diferencias significativas (P≥0.05), mientras que el tamaño del folículo al momento de la inseminación artificial a tiempo fijo expresó diferencias significativas (P≤0.05) con un mayor diámetro para J-Synch + eCG + Celo IA 60 horas midiendo 11.8± 0.1mm. Yánez et al., (2018) en su estudio expuso que el tamaño del folículo al retiro del dispositivo de progesterona para J-Synch con eCG 60 horas fue 9.53 ± 0.11mm y para J-Synch con eCG 72 h de 9.87± 0.12 mm, mientras que, a la IATF para J-Synch con eCG 60 horas fue 12,3±0,12 mm y para J-Synch con eCG 72 h de 11.9 ± 0.12 mm, sin mostrar diferencias significativa. Ortiz et al. (2017) en el estudio con protocolo convencional (DIB+BE+PG+ IATF 52- 56 horas) en vacas lecheras en la Amazonía, mostró que el tamaño de folículo preovulatorio a la IATF el T1 presenta el mayor diámetro con 15.86 mm, sin mostrar diferencias estadísticas entre tratamientos (P>0.05). En otra región del mundo Re (2018) utilizando vaquillonas lecheras evaluó los tratamientos grupo1 J-Synch n= 20 (DIB 0.5 gr y GnRH 56 horas), grupo2 J-Synch n= 20 (DIB 1.0 gr y GnRH 56 horas), grupo3 J-Synch n= 20 (DIB 0.5 gr y GnRH 72 horas), grupo4 J-Synch n= 20 (DIB 1.0 gr y GnRH 72 horas) el diámetro del folículo ovulatorio al retiro del dispositivo fue mayor en el 1 grupo con 7.7 mm, el diámetro del folículo ovulatorio a la IATF fue mayor para 4grupo con 13.4 mm mostrando diferencias estadísticas entre los tratamientos (P<0.05). Andringa et al. (2013) evaluando vacas Holstein, obtuvo 16.2 ± 1.7 mm como diámetro máximo del folículo preovulatorio. A diferencia de los datos encontrados por (Ludueña y Molfino, 2013) en vacas Holstein de una lechería comercial, hallaron que el tamaño del folículo dominante al retiro del dispositivo fue de 13.7 mm en las vacas que se preñaron y 12.7 mm en las vacías. Gamboa (2020) trabajó con vaquillas de la raza senepol en el trópico valorando el efecto de tres protocolos reportó diámetros del folículo preovulatorio de 10.37±0.4 mm; 10.04±0 mm y 9.24±0.4 mm, inferiores a los encontrados en la Amazonía. Menchaca et al. (2017) encontraron que el diámetro del folículo ovulatorio aumentó en la medida que se prolongó la duración del proestro. Sin embargo, Ospina y Ramos (2013) en vacas y novillas de raza Normando para leche, tratadas con un protocolo de IATF convencional, no tuvieron efecto positivo sobre el crecimiento folicular, y por el contrario presentaron disminuciones en las tasas de crecimiento de estos.

El momento de la ovulación para vacas lecheras de la raza Holstein en la Provincia de Pastaza desde la remoción del dispositivo (día 6) no fue significativamente diferente (P≥0.05) para los tratamientos T1: 106 ± 1.8; T2: 108 ± 2; T3: 114 ± 2.3 y T4: 114 ± 2.3 horas. Estos valores son mayores si se los compara con datos mostrados por Yánez et al., (2018) en vacas doble propósito de Pastaza, cuyo horario medio de ovulación para J-Synch con eCG a las 60 y 72 horas fue de 94.5±0.9 horas y para J-Synch sin eCG a las 60 y 72 horas fue de 88.0 ± 1.1 horas. Diferencias que probablemente se deban a muchos factores físicos ambientales extremos y propios del animal que no se puede controlar dentro del estudio, uno de ellos es el estrés calórico que afecta con mayor intensidad a vacas de la raza Holstein para leche. Datos que se asemejan a los encontrados en la Amazonía, Re (2018) con vacas de primer parto Holstein, reportó un promedio de ovulación más largo con 103.8 ± 3.0 horas, y superiores reportados por Andringa et al., (2013) donde las vacas estudiadas ovularon en promedio a las 40.1 ± 10.9 horas pos celo, con un rango que fue desde las 20 a 68 horas, también a los mostrados (Ludueña y Molfino, 2013) con ovulaciones antes 63.3 ± 2.1 horas, mientras que vacas que no presentaron celo hasta las 48 horas ovularon en promedio 75.7 ± 1.2 horas.

Los valores de horas en que produce la ovulación en vacas lecheras en la Amazonía son en este trabajo los primeros en obtenerse, será necesario seguir evaluándolas para saber si estos valores son puntuales a este trabajo o de comportamiento general para las vacas lecheras en este ambiente.

En referencia a la variable diámetro del cuerpo lúteo, en el estudio realizado en vacas lecheras en la Provincia de Pastaza se visualiza que el diámetro del cuerpo lúteo medido al día 7 pos IATF, difirió significativamente entre los tratamientos (P≤0,001) T1: 20.5 ± 0.2 mm; T2: 20.7 ± 0.2 mm; T3: 18.3 ± 0.6 mm y T4: 19.2 ± 0.4 mm) datos que se asemejan a los reportados por Ortiz et al., (2017) quién reporta que mayor diámetro alcanza el protocolo convencional aplicando eCG al día 8 y 14 del protocolo con un valor de 21.9 mm, mostrando diferencias estadísticas entre tratamientos (p<0.05). En el estudio realizado por Ruiz, (2017) en vacas lecheras revela que el tamaño de cuerpo lúteo fue mayor para el tratamiento (J-Synch sin AVAILA 4®) alcanzando los 22.9 mm al día 30 pos IATF, concluyendo que los tratamientos difieren estadísticamente (P<0.05), aunque no fue medido al día 7 pero muestra similitud con nuestro estudio en cuanto al rango se refiere. Yánez et al., (2018) en su experimento desarrollado en vacas doble propósito reporta que el diámetro del cuerpo lúteo medido al día 7 pos IATF, no difirió significativamente entre tratamientos (p>0,05) T1: J-Synch con eCG IATF 60 horas C.L= 23.1± 0.14mm; T2: J-Synch con eCG IATF 72 horas C.L= 22.8± 0.15mm, datos que superan a los valores reportados en nuestro estudio.

Para este grupo de vacas y con el sistema de producción utilizado se podrían manipular indistintamente cualquiera de los tratamientos evaluados. Aunque, mostraría una tendencia de mejor tasa de preñez el tratamiento J-Synch con eCG y IA 60 horas.

CÓDIGO DE ÉTICA

Los autores declaran que el estudio presentado se ha llevado a  cabo   de   acuerdo   con  el   Código  de   Ética   para   los experimentos  con  animales,   tal   y  como  se  refleja   en  la normativa: http://ec.europa.eu/environment/chemicals/lab_animals/legisl ation_en.htm.

CONFLICTO DE INTERESES

Los autores firmantes del presente trabajo de investigación declaran no tener ningún potencial conflicto de interés personal o económico con otras personas u organizaciones que puedan influir indebidamente con el presente manuscrito.

CONTRIBUCIONES DE LOS AUTORES

Preparación y ejecución: OC, M Desarrollo de la metodología: OC,  LP,  M  Concepción  y  diseño:  OC,  LP,  MPR  Edición  del artículo: OC, LP, M Supervisión del estudio: LP, M