La suplementación con probióticos (Saccharomyces cerevisiae) incrementa la respuesta Th1 en bovinos inmunizados con péptidos de superficie de Babesia bigemina.

Babesia bigemina es un agente causal de la babesiosis bovina en regiones tropicales y subtropicales del mundo, incluyendo México. Se ha demostrado que las respuestas inmunitarias de tipo Th1 se correlacionan con la protección de bovinos infectados. Los antígenos inmunodominantes de Babesia bigemina son muy variables, sin embargo, epítopos conservados, subdominantes están presentes en antígenos expuestos y pueden ser utilizados como candidatos vacunales. El objetivo de este trabajo fue el de comparar la respuesta inmune celular de bovinos inmunizados alimentados con una dieta suplementada con probióticos basados en levaduras vivas.

 

Un total de veinte péptidos de un rango entre 12 y 20 aminoácidos de longitud y conteniendo epítopos B conservados, obtenidos de siete antígenos candidatos vacunales de B. bigemina, fueron sintetizados químicamente como dendrímeros de 8 ramas, y utilizados en una mezcla como antígeno vacunal. Veinticuatro bovinos de una zona libre de garrapatas y libres de anticuerpos contra B. bigemina fueron distribuidos al azar en cuatro grupos (n=6). Los tratamientos evaluados fueron: 1) adyuvante con PBS y dieta; 2) adyuvante con péptidos y dieta; 3) adyuvante con péptidos y dieta suplementada con la cepa de levadura viva L18 (P7) de Saccharomyces cerevisiae; y 4) adyuvante con péptidos y dieta suplementada con la cepa de levadura viva F53 también perteneciente a la especie Saccharomyces cerevisiae. Los animales tuvieron un periodo de adaptación de veintiún días antes de la primera inmunización y a partir de entonces a todos los grupos se les dio la dieta respectiva cada día y por el resto del experimento. Todos los bovinos fueron inmunizados subcutáneamente cada tres semanas para un total de cuatro inmunizaciones con 1.5 mg de antígeno emulsionado con el adyuvante comercial Montanide 70 VG. Diez días después de la última inmunización, se colectaron muestras de sangre y éstas se utilizaron para evaluar la linfoproliferación in vitro y el perfil de expresión de citocinas. Para esto, las células mononucleares de sangre periférica (PBMC) fueron purificadas con Lymphoprep centrifugándolas a 800 × g durante 20 min a 25 °C. Las células vivas fueron contadas en un hematocitómetro. Para los ensayos de linfoproliferación con el antígeno vacunal se siguió el diseño experimental de linfoproliferación con estimulación con 5 µg/mL de antígeno nativo y el vacunal de Babesia bigemina. Todos los ensayos se realizaron al mismo volumen final de 100 µl por pozo, así como la misma cantidad de células por pozo (3 × 105 ) en placas de 96 pozos para cultivo celular. En cada ensayo se usó un control negativo con células sin el antígeno. Se estimularon las células con el antígeno por triplicado en cada ensayo, la estimulación de las células se realizó por 72 h en cultivo en una incubadora a 37°C con 5% de CO2. Posterior al periodo de incubación se realizó la lectura de las placas a 72 h post-inducción. Para esto se adicionaron 20 µL de MTS (Celltiter) en cada pozo. La placa se incubó 2 h a 37°C con 5 % de CO2 y pasado el tiempo, la placa se leyó en un lector de Elisa a 490 nm. El perfil de citocinas se realizó cuantificando la producción de las siguientes citocinas: INF-gama, IL-12, IL-2, IL-4, IL-5 e IL6, el cual se hizo mediante un Inmunoensayo Ligado a Enzimas (ELISA) comercial. Para esto, en un experimento simultáneo, PBMCs purificados fueron estimulados con el antígeno vacunal por 72 h en una incubadora a 37°C con 5% de CO2. Los sobrenadantes del cultivo celular se obtuvieron centrifugando los cultivos a 3000 rpm durante 15 minutos para remover los restos celulares. Las muestras fueron almacenadas a -80 °C hasta su análisis. Para la detección de IL-12, IL-5 e IL-2 se utilizaron kits comerciales y se procedió de la siguiente manera: Se colocaron 100 µl de las soluciones estándar, así como de las muestras a analizar y 100 µl de Solución Salina de Fosfatos (PBS) en cada pozo, en todos los casos se colocó la solución por duplicado. Cada prueba de ELISA se realizó de acuerdo a las indicaciones del fabricante y los valores se determinaron en un lector de ELISA. Las mediciones de las densidades ópticas se procesaron en Excel para obtener los valores promedio de los duplicados, estos datos fueron analizados con el Software MasterPlex ReaderFit para generar una curva de regresión lineal de cuatro parámetros (4-PL) cuya construcción fue basada en los valores de las densidades ópticas arrojadas por los estándares. De esta manera se obtuvieron las concentraciones correspondientes a cada muestra en pg/ml. El análisis estadístico se realizó utilizando un análisis de varianzas (ANOVA) complementado con una prueba de Tukey.

 

Los resultados del ensayo de linfoproliferación estimulando con antígeno crudo indicaron que el grupo 2 (bovinos inmunizados sin inclusión de levadura en la dieta) comparado con el grupo 1 (bovinos sin inmunizar y sin inclusión de levadura en la dieta) tuvo una respuesta inmunitaria celular más alta (p<0.05). El grupo 3 (bovinos inmunizados y suplementados con P7) tuvo una respuesta inmune celular aun más alta que el grupo 1 (p<0.001). Cuando el ensayo de linfoproliferación se realizó estimulando con los péptidos vacunales, se observó que los grupos 3 y 4 (bovinos inmunizados y suplementados con las cepas de P7 y F53, respectivamente) mostraron una mayor respuesta de linfoproliferación comparados con el grupo 2 (p<0.05). La determinación del perfil de citocinas mostro los siguientes resultados: no se encontraron diferencias significativas en la expresión de IFN-γ entre los grupos (p>0.05), aunque el grupo 3 (bovinos inmunizados y suplementados con P7) tuvo la producción mas elevada, seguido del 4, del 2 y finalmente el 1. Para la IL-12, se observó que el grupo 2 (bovinos inmunizados sin inclusión de levadura) tuvo una mayor expresión comparado con los demás grupos (p<0.05). Cuando se evaluó la IL-2, se observaron diferencias estadísticas entre los grupos 1 y 3, y los grupos 1 y 4 (p<0.05). Para las citocinas IL-4, IL5 e IL-6 los resultados no mostraron diferencias significativas entre los grupos.

 

Todos estos resultados muestran que los péptidos seleccionados de B. bigemina inducen una respuesta inmune celular específica, caracterizada por una expresión elevada de citocinas Th1.

 

El perfil de la respuesta inmunitaria generada correlaciona con protección en babesiosis bovina. La respuesta inmune celular fue mejorada al suplementar con probióticos (Saccharomyces cerevisiae) en bovinos inmunizados.