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Evaluación de un ensayo de PCR dúplex para la detección de Salmonella spp. y Staphylococcus aureus en leche

Publicado: 12 de mayo de 2020
Por: Y.A. Martínez-García, A. Martínez-Vasallo, O. Uffo-Reinosa, Y. Riveron Alemán, J.A. Agüero, E. Quiñones y E. Roque Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (CENSA), San José de las Lajas, 32700, Mayabeque, Cuba.
Resumen

Las enfermedades transmitidas por los alimentos (ETA), se producen por microorganismos o bacterias patógenas infecciosas o toxigénicas. Entre estos los de mayor importancia asociados a brotes gastrointestinales agudos se encuentran Salmonella spp. y Staphylococcus aureus, presentes en alimentos contaminados. La leche al igual que otras matrices alimenticias se convierte en un vehículo ideal en la transmisión de bacterias patógenas al ofrecer un medio rico en nutrientes para el desarrollo de los microrganismos; la principal causa de contaminación de este alimento es la deficiente higiene en la obtención y manipulación. Los índices de ETA a nivel internacional causados por leche y derivados lácteos alcanzan hasta un 6%. La importancia del diagnóstico rápido y certero de estos microorganismos patógenos alcanza gran relevancia debido a que este alimento es muy consumido por la población de alto riesgo (niños, ancianos, personas inmunodeprimidas). El presente estudio tuvo como objetivo desarrollar un ensayo de dúplex PCR para la detección simultánea de Salmonella spp. y Staphylococcus aureus a partir de muestras de leche. El principio del método se basa en la amplificación de los genes yfiR (375 bp) y ARNr 23S (499 bp) utilizando los pares de cebadores TS-11/TS-5 y 23S-1200/23S-1698, simultáneamente. Se determinaron las propiedades termodinámicas de cada cebador con el empleo del programa Vector NTI Advance® Versión 11.5.3 y se optimizaron los principales parámetros críticos del ensayo de dPCR para lo que se determinaron las condiciones óptimas del ensayo y los indicadores de desempeño. El PCR dúplex optimizado demostró su especificidad al solo obtener amplicones frente al ADN de los microorganismos diana y el límite de detección del ensayo detecto valores hasta 1 pg/µL de ADN y 102 ufc/mL en leche estéril. Las muestras de leche cruda analizadas presentaron un 46,7% de presencia de S. aureus, ninguna muestra fue positiva a la presencia de Salmonella spp. Los resultados sugieren que el PCR dúplex desarrollado es un ensayo efectivo, específico para la detección simultánea de ambos patógenos a partir de leche

Palabras claves: Salmonella spp.; Staphylococcus aureus; PCR; ADN; estandarización; optimización; cebadores.

Introducción
Las Enfermedades de Transmisión Alimentaria (ETA), constituyen una importante causa de morbilidad y mortalidad, así como un significativo impedimento al desarrollo socioeconómico en todo el mundo (WHO/FOS, 2015.). Los brotes de ETA provocados por leche y productos lácteos contaminados han sido descritos a nivel mundial, reportándose Salmonella spp., Campylobacter spp., Escherichia coli, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolítica, Mycobacterium bovis, Brucella spp., Coxiella burnetti (Oliver et al., 2005; ECDC ECfDPaC, 2017) como los principales agentes causales.
Salmonella spp. es una de las principales bacterias patógenas que causa daños a los seres humanos y a los animales por el consumo de alimentos. Se ha reportado como la principal causa de gastroenteritis aguda en varios países (Addis et al., 2011). En la leche cruda alcanza una prevalencia de hasta 6 % en muestras de tanque (Jayarao et al., 2006; van Asselt et al., 2017). Las vías de contaminación pueden ser a través del ganado actuando como reservorio, contaminaciones fecales de los pezones, superficies de la ubre, máquinas de ordeño o contaminación post-pauterización en las plantas de producción (Labbé y García, 2013; D'AMICO et al., 2008). La intoxicación por Staphylococcus spp. es una de las causas comunes de brotes de origen alimentario a nivel mundial. Desde la perspectiva de la seguridad alimentaria su importancia se deriva de la capacidad de producir enterotoxinas (Hill et al., 2012) y su presencia en la leche y derivados lácteos se debe principalmente, a la contaminación con casos clínicos o subclínicos de mastitis, deficiente higiene durante el proceso de obtención o de los trabajadores de (Oliveira et al., 2011).
En Cuba, los reportes sobre calidad bacteriológica en leche cruda son escasos, sin embargo, Martínez et al. (2015) indicaron que el 55,8 % de 360 muestras en el eslabón primario de la cadena de producción de leche fueron positivos a la presencia de Salmonella spp. En este mismo estudio, la media de los conteos de Staphylococcus coagulasa positivo fue superior a1x103 ufc/mL en todas las muestras analizadas.
Recientemente se ha incrementado el uso de métodos moleculares basados en la identificación de ácidos nucleicos como la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa), ya que estos permiten tomar decisiones rápidas algo de vital importancia en la industria alimentaria (Law et al., 2015). Internacionalmente se han descrito ensayos para la detección de Salmonella spp. y S. aureus, tanto en formato simple como en multiplex (Gwida y Al-Ashmawy, 2014; Botero y Esteban, 2013), reconocidos como métodos alternativos para el diagnóstico de estas bacterias en los alimentos (ISO-16140, 2016). Estos ensayos son considerados como métodos alternativos por lo que es necesario realizar una optimización en el laboratorio donde se va a emplear. En esta investigación se consideró la optimización y evaluación un ensayo de PCR dúplex para la detección de S. aureus y Salmonella spp.
Materiales y Métodos
Cepas: Se utilizaron las cepas de referencia: Salmonella typhimurium ATCC 14028 y Staphylococcus aureus (S. aureus) ATCC 29213. Las cepas se almacenaron a -20 0 C en caldo triptona soya con glicerol. La extracción de ADN se realizó empleando el protocolo descrito por Ahmadi et al. (2010) con algunas modificaciones. Reacción de PCR: se emplearon los cebadores descritos por Kawasaki et al. (2005) y Cremonesi et al. (2005), Tabla 1.
Evaluación de un ensayo de PCR dúplex para la detección de Salmonella spp. y Staphylococcus aureus en leche - Image 1
Volumen final de amplificación 25μL [5μL GoTaq Flexi Buffer Green 5x; 2μL MgCl2 (25 mM); 0,5μL dNTP (10 mM); 0,2μl Taq Polimerasa GoTaq® Flexi DNA Polymerase 5U/μL, Promega, EE.UU], 1μl (20 mM) cebadores; 8,3μL de agua libre de nucleasas y 5μL de ADN. Programa de amplificación (3-Prime Personal Thermal Cycler, TECHNE; Reino Unido): 95ºC por 5 min, seguido por 30 ciclos de 95ºC por 1min, 56ºC por 1min, 72ºC por 1min y una extensión final de 72ºC por 7 min.
Optimización de los parámetros críticos del ensayo de PCR dúplex:Se realizaron variaciones en los principales parámetros tales como las concentraciones de MgCl2, cebadores, temperatura de alineamiento. Se evaluaron los parámetros de desempeño analítico de la técnica, especificidad y límite de detección de la técnica (sensibilidad analítica).
Detección de Salmonella spp. y S. aureus en muestras de leche cruda
Se tomaron 60 muestras de leche crudas según la Norma IDF 50/ISO 707:2012, las cuales fueron previamente caracterizadas, por la Prueba de California (CMT) y el Tiempo de Reducción del Azul de Metileno (TRAM), de acuerdo a los requisitos microbiológicos de la NC-ISO 448:2006. Las muestras se analizaron por el método de PCR dúplex.
Resultados
El método de extracción permitió obtener la concentración suficiente de ADN para desarrollar el ensayo de PCR, la relación A260/A280 del ADN obtenido se encontró en los rangos de 1,60 y 1,90. Las concentraciones de ADN obtenidas en este estudio son similares a las descritas en estudios realizados por Cremonesi et al. (2006), quienes utilizaron un protocolo de extracción de ADN basado en la utilización de tiocianato de guanidina, centrifugación y tratamiento térmico.
Se seleccionó 0,6µM como el valor óptimo de concentración de cebadores en 25µL; la temperatura de alineamiento para el ensayo se estableció a 60°C, esta temperatura posibilita la amplificación con bandas nítidas, para ambos pares de cebadores garantizando la especificidad del ensayo; la concentración óptima de MgCl2 fue de 2mM.
El ensayo de dPCR optimizado demostró ser específico para el diagnóstico de las bacterias en estudio, ya que solo se obtuvo amplificación frente al ADN de Staphylococcus aureus y Salmonella spp. (Figura 1).
Evaluación de un ensayo de PCR dúplex para la detección de Salmonella spp. y Staphylococcus aureus en leche - Image 2
El ensayo evaluado presentó una alta especificidad, comparable con estudios realizados por Cremonesi et al. (2006), los cebadores basados en el gen ARNr 23S para el diagnóstico de S. aureus, en muestras de leche y demostró una especificidad del 100 %, en cultivos y en leche cruda contaminada. Tsen et al. (1994), reportaron la especificidad de los cebadores TS-11/ TS-5 frente a 327 cepas de Salmonella spp de diferentes serotipos, los cuales no tuvieron reacción positiva frente al ADN de 56 cepas de otras enterobacterias, al igual que Kawasaki (2005) reportó una especificidad del 100 % con esta pareja de oligonucleótidos para la detección de Salmonella spp. Los resultados demuestran que el ensayo es eficiente en el uso de múltiples pares de cebadores, obteniéndose el LD hasta 1pg/μL
Se obtuvo un total de 28 muestras positivas (46,7 %; IC 95 %: 34 – 59,3 %) a la presencia de S. aureus, la presencia de esta bacteria en leche puede significar la afectación de los animales con mastitis bovina o deficiente higiene en la obtención de la leche (Gillespie y Oliver, 2005). No se detectó ninguna muestra positiva a la presencia de Salmonella spp. Se puede suponer que la presencia de este microrganismo en muestras de leche cruda depende de diferentes factores como: la circulación de la bacteria en el ambiente, el tamaño y salud de los animales y las condiciones de manejo del rebaño (D'AMICO et al., 2008).
La principal contribución de este estudio fue el desarrollo de una metodología para el diagnóstico de Salmonella spp. y S. aureus a partir de pre-cultivos de la muestras analizadas, con lo que se incrementó los niveles de sensibilidad de la técnica y se disminuyó el tiempo de recuperación de dos microrganismo de vital importancia para la salud pública y veterinaria con respecto a los métodos convencionales de cultivo. El empleo de un pre-cultivo permite la posibilidad de analizar diferentes matrices con un mismo ensayo. El ensayo de PCR dúplex evaluado constituye una herramienta que agiliza y fortalece el diagnóstico de S. aureus y Salmonella spp. en leche lo cual permite liberar los productos alimenticios en un menor tiempo.

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Autores:
Yuneilys
CENSA - Centro Nacional de Sanidad Agropecuaria (Cuba)
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