Comparación de tres pruebas diagnósticas para el aborto por rinotraqueitis infecciosa bovina en hatos lecheros

Resumen

El presente trabajo compara la sensibilidad (Se), especificidad (Es), valor predictivo positivo (VP(+)) y valor predictivo negativo (VP(-)) de las pruebas de inmunoperoxidasa (IP) e inmunofluorescencia (IF) para el diagnóstico de abortos causados por rinotraqueítis infecciosa bovina, así como la concordancia de los resultados con los de seroneutralización (SN) en las madres de dichos fetos, tomando como prueba estándar de diagnóstico el aislamiento viral (AV). Se evaluaron 49 fetos abortados, obtenidos a lo largo de un año. A cada uno se le tomaron muestras de hígado, bazo, riñón y pulmón; de las madres se obtuvieron tres muestras de suero, con intervalo de un mes, obteniendo la primera a partir del aborto. Las muestras se tomaron en el Complejo Agropecuario e Industrial de Tizayuca (CAIT), en Tizayuca, Hidalgo, México; las técnicas diagnósticas se realizaron en el Centro Nacional de Servicios de Diagnóstico en Salud Animal (CENASA) conforme lo establecido en el mismo centro y por la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). Se obtuvieron 29 aislamientos virales de IBR del total de las muestras. La prueba de IP tuvo una Se de 96.7% y Es de 20%, VP(+) de 64.4% y VP(-) de 80%. La prueba de IF tuvo una Se de 24.1% y una Es de 70%, un VP(+) de 53.8% y VP(-) de 38.9%. La concordancia para ambas pruebas fue mala. Respecto del órgano, la muestra de hígado y riñón fueron las mejores para diagnóstico de IBR por IF e IP, respectivamente. La concordancia para SN, IF e IP con respecto al AV no fue significativa (P > 0.05).

Palabras clave: IBR, DIAGNÓSTICO, ABORTOS,PRUEBAS DIAGNÓSTICAS.


Introducción

Un agente viral asociado a brotes de enfermedades respiratorias del bovino esel Herpes Bovis 1 (BHV-1) de la familia Herpesviridae que ocasiona la rinotraqueítisinfecciosa bovina (IBR). Según el análisis genómico y tipoantigénicos, el BHV-1 se divide en BHV-1.1 y BHV-1.2, que, a su vez, sesubdivide en subtipo BVH-1.2a y BHV-1.2b.¹ Las manifestaciones clínicasy curso de la enfermedad dependen del sitio anatómico de la infección,la edad y el estado inmunológico del portador,^2,3 produciendo desde uncuadro clínico respiratorio (rinotraqueítis, conjuntivitis), genital(vaginitis, epididimitis, orquitis y aborto), enteritis y hasta enfermedad sistémica.^1,2

La enfermedad tiene un periodo de incubación de 21 días, en promedio.4Cuando la infección ocurre en forma subclínica,1 aquéllase caracteriza por la interrupción de la gestación, lo cual sucedeen 25% al 50% de las vacas gestantes; si la infección se establece tempranamenteen la gestación puede provocar reabsorción embrionaria, pero sila muerte ocurre en los dos primeros trimestres de la gestación (cuando éstaes dependiente del cuerpo lúteo por progesterona) el intervalo entre lamuerte fetal, la luteolisis y la expulsión es suficiente para la autolisisfetal. Generalmente el aborto ocurre en el tercer tercio de la gestación,en un tiempo no mayor a tres semanas en el que el feto está autolizado.^1,2,5,6
La prevalencia en hatos depende de factores como el estado inmunitario de lamadre, el periodo de la gestación en que ocurra la infección osi se manifiesta ésta, del tropismo y la virulencia del agente.¹
En muestras enviadas al Centro Nacional en Servicios de Diagnóstico enSalud Animal, entre enero de 1992 a febrero de 1996, se obtuvo una frecuenciade positivos de 56.53% en 18 estados de la República mexicana.
La transmisión del virus se realiza a través de las secrecionesrespiratorias, oculares o del aparato reproductor, como el semen, implante deembriones y las operaciones obstétricas.⁷
El virus puede mantenerse latente en los rebaños, por la presencia debovinos portadores de cepas de campo que se reactivan ocasionalmente bajo diversosestímulos con la consecuente replicación viral a travésde los tractos respiratorio y reproductor, lo cual favorece la transmisióna los animales susceptibles. Esta situación hace que la IBR sea una enfermedadde gran difusión y de muy difícil control.^5,7,8
Desde un enfoque económico, la  importancia de la IBR aúnno ha sido evaluada completamente, pero se calcula que en diez años seremueve 18% del hato por enfermedades infecciosas, de las cuales es relevanteel aborto.⁹ La IBR es una enfermedad enzoótica de notificaciónobligatoria en México por su efecto significativo en la producciónpecuaria. Además, pertenece al grupo B del Código ZoosanitarioInternacional por su  importancia estratégica para las acciones desalud animal en cada país.^4,10
En México, la IBR es una de las enfermedades infecciosas de gran importanciaen los hatos lecheros, pues en la mayoría de los animales la enfermedadtranscurre en forma subclínica; tiene como principal característicael aborto y como consecuencia la pérdida de la cría y la lactancia,afectando los parámetros reproductivos y productivos e incrementando notablementelas pérdidas económicas.
Las técnicas comunes para el diagnóstico de IBR son: seroneutralización,fijación del complemento, ELISA, neutralización viral, aislamientoviral, inmunofluorescencia e inmunohistoquímica.^{1, 11}
La prueba de sueroneutralización tiene como propósito buscar anticuerposneutralizantes en el suero de los animales. Si se utiliza la incubaciónconvencional del virus de 1 hora a 37ºC, la prueba presenta una sensibilidadde 89.2% y especificidad cercana a 100%. Sin embargo, si los reactivos se incubandurante 24 h, es posible aumentar la sensibilidad a 94.4%, pero la especificidaddisminuye a 93.2%.¹² Una limitante de esta prueba es que sólo es certeraen hatos donde no se vacuna.¹
La prueba de inmunofluorescencia se utiliza para identificar antígenoso anticuerpos en material fresco (riñón y glándulas adrenales)^1,13-15La prueba indirecta es más sensible, pero no lo suficiente para justificarsu uso, ya que es más demorada.15,16 En el examen directo de seccionescongeladas de riñón fetal, la prueba tiene especificidad superiora 90% y sensibilidad de 67%.^15,16
Para la técnica de inmunoperoxidasa se realizan impresiones en láminasportaobjetos a partir de los tejidos sospechosos. Estos últimosse incubancon anticuerpos contra el virus de IBR conjugados con una enzima, generalmenteperoxidasa de rábano picante. Después de lavada, la impresiónes tratada con el sustrato de la enzima y un cromógeno cuyos productosprovocan una reacción coloreada directamente proporcional a la cantidadde antígeno presente en la muestra.^17,18 Según Smith et al.,¹⁷esta prueba tiene sensibilidad de 94%.
Esta técnica tiene dos ventajas para el diagnóstico; una es queno se necesitan microscopios equipados para la observación con luz ultravioletay otra es que pueden fijarse directamente los cultivos celulares infectados enlas mismas microplacas utilizadas para el aislamiento viral.
Otra prueba diagnóstica es el aislamiento viral, que tiene por inconvenientessu lentitud, ya que tarda al menos una semana; requiere de equipo, material ypersonal especializados. Si las muestras no se trabajan inmediatamente o sonalmacenadas, deben congelarse a -70°C. Cultivos de células en monocapa,homólogas o primarias se incuban a 37°C y se observan diariamentepara comprobar la aparición de efecto citopático, este efecto debevalorarse en comparación con cultivos no inoculados llamados testigosnegativos, en especial en casos de virus que precisan periodos de incubaciónsuperiores a una semana.^10,19,20
Algunos autores mencionan que el diagnóstico en abortos sólo seconfirma por examen de tejido fetal.¹ Aunque los diferentes aislamientos viralesobtenidos de distintas formas clínicas de la enfermedad difieren en suafinidad por los distintos órganos, resultan serológicamente idénticos.¹⁶
A nivel oficial, para diagnóstico de IBR  se debe utilizar la pruebade seroneutralización, que ha sido aceptada internacionalmente como pruebade referencia.^10,20
Como consecuencia de lo anterior es necesario una prueba alternativa de equivalentevalor o mejor especificidad, sensibilidad y más rápida para detectarapropiadamente a los animales y fetos infectados en las condiciones existentesen campo.

Material y métodos

El estudio se llevó a cabo en el Complejo Agropecuario e Industrial deTizayuca (CAIT), en Tizayuca, Hidalgo, México, mediante un muestreo noprobabilístico por conveniencia en el que se evaluaron los fetos abortadosobtenidos mediante la notificación de los encargados o dueños,o ambos, de los establos al laboratorio de patología del CAIT, y los suerosde las vacas y vaquillas progenitoras de aquéllos a lo largo del peridode estudio.
A los fetos obtenidos se les realizó la necropsia conforme a lo descritopor Aluja,²¹ disecando: hígado, bazo, riñón y pulmón,de cada uno se obtuvieron aproximadamente 2 cm³, que se colocaron en frascosde vidrio estériles identificados y mantenidos en congelación a-4ºC durante uno a dos días hasta su traslado al Centro Nacionalen Servicios de Diagnóstico en Salud Animal (CENASA), donde se analizaron.
El día en que cada vaca abortó, se le tomaron 10 ml de sangre  mediante  punciónen la vena coccígea. El suero se clarificó por centrifugacióna 1875 g durante 15 minutos y se colocó en viales estériles;este proceso se repitió a los 30 y 60 días después del aborto.Las muestras se conservaron en congelación a -4?C hasta su análisis.


Análisis de los órganos
A cada muestra de órgano se le realizaron pruebas de: aislamiento viral(AV), inmunoperoxidasa en placa (IPP), inmunoperoxidasa directa (IP) e  inmunofluorescenciadirecta (IF).
Para el diagnóstico por AV se realizó un macerado con aproximadamente0.5 g de cada órgano (2 g en total) en 18 ml de MEM (medio esencial mínimo),conteniendo 0.2 ml de bicarbonato al 2%. Se filtró en una membrana de0.45 µm, la técnica se realizó según la OIE.^18,19
Se utilizaron las líneas celulares MDBK y PK15 inoculándose cincobotellas de 5 ml por línea celular y por muestra; las botellas se observarondiariamente durante cinco días para detectar efecto citopático.Si no hubo efecto durante esos días se realizaron de tres a cinco pasespor muestra de feto; simultáneamente se realizó IPP en placa de96 pozos para evidenciar que el aislamiento viral fuera IBR.

Cada laminilla se lavó con PBS, se decantó y secó, después se agregaron 25 µL de conjugado contra IBR, se incubó  a 37ºC durante 30 minutos en cámara húmeda, luego se lavó con  PBS y se secó para montarlos con glicerina amortiguada y observarlos al microscopio de epifluorescencia.

Cada laminilla se lavó con solución de lavado SL  (PBS y Tween), se decantó y se secó para agregar conjugado (suero de referencia), se incubó una hora a 37ºC en cámara húmeda en una estufa de CO2; posteriormente se decantó y lavó con SL durante tres veces, se secó y se le adicionó proteína G conjugada, se incubó de nuevo durante 30 minutos a 37ºC en cámara húmeda en estufa de CO2, y se lavó en tres tiempos con solución SL.
Se agregaron 50 µL de 3,9 aminoetilcarbazol como indicador diluido en solución de fosfato de sodio y ácido cítrico más el sustrato y se incubó 20 minutos a temperatura ambiente (el indicador se preparaba en el momento de usarlo); se lavó y se observó en microscopio óptico con objetivo seco débil, seco fuerte e inmersión
Para ambas pruebas se consideró una muestra positiva cuando al menos en una de las cuatro muestras de órgano de un solo feto dio una reacción positiva a IP y a IF directa.

Análisis del suero
A los sueros de las madres se les realizó la prueba de seroneutralización(SN) conforme a lo establecido por la OIE y la FAO.^19,20 El suero hiperinmunese trabajó a dilución de 1:520.²² Para la comparación entrelas pruebas, el AV se utilizó como estándar diagnóstico(prueba con sensibilidad cercana al 100%).^18,19

Al comparar IP e IF directa con AV se obtuvieron las proporciones de verdaderos positivos, verdaderos negativos, falsos positivos, falsos negativos, la Se, la Es, el VP(+) y el VP(-) en cada prueba. Con estos resultados se compararon las pruebas de IP e IF y se calculó el índice de concordancia bruta (ICB) y la concordancia por índice de Kappa (IK) con SN.^23,24 Para la realización del análisis estadístico se utilizó el programa EPIINFO 6.

En el periodo de estudio se obtuvieron 86 muestras de fetos abortados, de éstas sólo fue posible analizar 49 debido a la autolisis.

Aislamiento viral
 De las 49 muestras de fetos analizadas, en 29 (59%) se aísló el virus de la IBR (Cuadro 1).

Inmunofluorescencia e inmunoperoxidasa
El  26.5% de las muestras fueron  positivas por IF y 89.7% a IP (Cuadro1). Al analizar cada prueba por órgano, se encontró que para IFla frecuencia de positividad varió de 13% a 18% para bazo e hígado,respectivamente, sin encontrar diferencia significativa (p = 0.9205) (Cuadro2). Para IP por órgano se encontró variación de positividadde 42% a 74% en hígado y riñón, respectivamente. Dicha variaciónfue significativa (p = 0.012) (Cuadro 2).

Sensibilidad (Se), especificidad (Es) y concordancia entre aislamientoviral e inmunofluorescencia
La prueba de IF presentó Se de 24.1% y Es de 70%, Vp+ de 53.8% y Vp- de38.9%; la concordancia por IK entre ambas pruebas fue de -0.052, la cual no fuesignificativa (IK = -0.052, p = 0.6) (Cuadro 3). Por órgano, IF presentamuy baja Se ya que va de 10% a 20%, mientras que la Es va de 79 a 88% para bazoy pulmón, respectivamente; en todos los órganos la concordanciapor IK con el AV no fue significativa (Cuadro 4).

Sensibilidad, especificidad y concordancia entre aislamiento viral e inmunoperoxidasa
La prueba de IP presentó Se de 96.7% y Es de 20% un Vp(+) de 64.4% y unVp(-) de 80%. La concordancia por IK entre ambas pruebas fue 0.19, que no fuesignificativa (IK = 0.19, p = 0.002) (Cuadro 3). Por órgano IP presentavariaciones en Se, Es, VP(+) y VP(-), teniendo la mejor respuesta en hígadocon una concordancia significativa (IK = 0.3827, p = 0.0033) (Cuadro 4).

Seroneutralización
De los 49 fetos analizados sólo fue posible obtener muestras de suerode 38 de sus madres en el primer muestreo, 34 en el segundo y 26 en el tercero,ya que los ganaderos no permitieron la toma de más muestras. El valorpromedio de anticuerpos contra IBR de los animales que abortaron  en generalfue de 1:32. Al comparar SN con AV se encontraron variaciones en su Se y Es,las cuales fueron determinadas por diferentes puntos de corte. Los resultadosmostraron concordancia significativa sólo al considerar como positivoslos sueros del primer muestreo con valores de 1:32 o mayor (IK = 0.27, p = 0.04),y aun en ese caso destaca que la Se fue de 68% y la Es de 61.5% (Cuadro 5).

En relación con las características de la IP como prueba diagnóstica, se encontró que la Se fue mayor (96.7%) a la encontrada por Smith et al. y Delgado et al.,^15,17 quienes determinaron una Se de 96% por avidina-biotina y de 83.3% por la técnica directa, respectivamente. Sin embargo, la Es encontrada (20%) fue menor a la notificada por Delgado et al.,¹⁵ que fue cercana a 100% . La alta cantidad de falsos positivos derivada de la baja especificidad, posiblemente se debió a una coloración inespecífica focal que proporciona la muestra y que da la morfología de los vasos sanguíneos y la presencia de glóbulos rojos en éste, como lo han mencionado Smith y Theodoris.^12,25 Otra posible explicación es que el suero o la muestra, o ambos, estuviesen contaminados con otro tipo de proteínas, como las de origen bacteriano y también a la posible reacción cruzada con otros herpes virus.²⁶ Otra causa en la variación de los resultados podría ser  una baja concentración de anticuerpos en el suero que se emplea para revelar la presencia del antígeno, como lo menciona Kramps.3 Además, la coloración no puede ser visible si la concentración de antígeno en el tejido es mínima, impidiendo que el conjugado detecte su presencia, como lo señalan Delgado y Kelling.^15,26

La IP realizada en placa para confirmar el AV favorece la posibilidad de encontrarel antígeno, ya que para elaborar esta técnica se realiza un maceradode todos los órganos (pool), mientras que la técnica directaen corte por congelación no garantiza que en la porción de tejidoevaluada se encuentre el antígeno en animales seropositivos. Posposil etal.²⁷ han demostrado presencia del virus en hígado, riñón,pulmón y otros órganos de fetos abortados de animales seronegativosy en algunos seropositivos infectados experimentalmente. En casos severos deautolisis, las muestras no pudieron ser evaluadas por IP ni por IF, debido aque el tejido se desprendía al momento de lavarlo durante el proceso delas técnicas.

En los cortes de tejidos congelados, si bien no siempre se apreció laanatomía del órgano evaluado debido a la autolisis, esta condiciónno interfirió con la interpretación de la prueba de IP, ya quela coloración obtenida en los casos positivos fue muy evidente, por loque todos los tejidos pudieron ser evaluados, no así con IF en la cualante condiciones de autolisis se observó coloración inespecíficade color rojizo, dificultando en la interpretación de los resultados,lo cual coincide con lo que mencionan Theodoris et al²⁵. yReed et al.²⁸ Cabe señalar que en las muestras que no presentaronsevera autolisis la fluorescencia encontrada fue focal y poco brillante distribuidauniformemente en el núcleo y citoplasma, consistentemente en riñón,lo cual concuerda con lo encontrado por Reed et al.²⁸

La Se y Es obtenidas por IF (24.1%, 70%) fueron menores a las encontradas porDelgado et al. y Smith et al.^15,17 quienes obtuvieron Se de67% y 83.3%, respectivamente, no así la Es, ya que Delgado et al.¹⁵encontraron 100% bajo condiciones de laboratorio. La baja Se pudo ser debidaa la autolisis de las muestras, así como a las mismas razones descritaspara IP y al tratamiento que se le da a la muestra, el cual puede afectar elsitio antigénico, a la calidad de los anticuerpos en el suero para revelarla presencia del antígeno.²⁶

La correlación entre el AV y la IF encontrada por Reed et al.²⁸fue de 50%. Por su parte, Bratanich et al.¹⁴ menciona una concordanciade 83%, la cual fue mayor a la encontrada en el presente estudio de sólo42.9%.

En este estudio los órganos de elección para envío de muestrasal laboratorio fueron el hígado, riñón y pulmón,ello que concuerda con lo señalado por Smith et al.¹⁷

La variación en los valores de SN, que van de 1:2 hasta mayores de 1:128,en las vacas al momento del aborto, coinciden con lo señalado por S. VanDrunen et al.²⁹ Un problema con la evaluación serológicafue tratar de diferenciar los sueros positivos, debido a que podían encontrarseanticuerpos inducidos por infección natural o por vacunación, sobretodo si se considera que los títulos pueden ser semejantes tanto en lavacunación como en la infección natural.³⁰ Cabe señalarque en el CAIT al principio del muestreo algunos animales fueron inoculados convacuna atenuada termosensible, y durante el estudio en todas las vacas se utilizó vacunainactivada o modificada, incluso en algunos casos los animales fueron vacunadoscon los dos tipos de vacuna. Destaca el hecho de que cualquiera de las vacunasaplicadas genera una respuesta observable hasta por más de treinta meses.^2,26,30,31

Si bien se ha mencionado que la vacunación puede provocar aborto, algunosautores indican que en hatos de reciente infección los animales presentanserología negativa, por lo que cabe destacar que en el CAIT hubo dos animalescon valores mayores a 1:128 en el momento del aborto y que presentaban signosrespiratorios sugestivos de IBR y no estaban vacunados, lo cual evidencia lacirculación del virus en el área estudiada.^2,8,29,32

Los títulos altos de éstos y otros animales encontrados y que presentaronaborto, pudieron deberse a que se infectaron en el lugar de origen, ya que seha encontrado que el tiempo transcurrido entre la infección materna yla fetal es variable y puede fluctuar desde ocho días hasta varios meses.³³

Por otra parte, no fue posible evaluar la concordancia de SN con las pruebasde IP e IF, ya que los resultados obtenidos pudieron deberse a la presencia delantígeno en el feto de madres inmunizadas con vacuna inactivada en untiempo no mayor a seis meses entre vacunación y el aborto, no estandode acuerdo con Posposil,²⁷ quien indica que aplicar una vacuna de este tipo evitaque el virus llegue al feto tanto en animales seropositivos como seronegativos;sin olvidar los mecanismos de defensa del huésped y el agente, o posiblementeel virus circulante sea vacunal, por otra parte, se conoce que la interacciónentre IBR y DVB (Diarrea Viral Bovina) tiene efecto inmunosupresor para la activaciónde IBR en ganado infectado.³⁴

Se concluye que la IP e IF directa no fueron métodos rápidos yconfiables para la detección del herpes virus bovino en tejidos fetales.Ambas pruebas tuvieron una Es limitada para detectar al virus; cabe señalarque tanto la IP como la IF resultaron métodos menos laboriosos y costososque el AV para la detección del herpes virus bovis. Otras variables quepueden afectar el resultado de las pruebas son el tiempo que transcurre desdela toma de la muestra hasta la realización de la prueba diagnóstica,la autolisis, la calidad del conjugado, el tiempo de vacunación y el momentodel aborto donde la excreción viral es mínima.

No se encontró relación entre los resultados de IP e IF respectode los de SN; la prueba de SN ha sido aceptada internacionalmente como la técnicade referencia; por lo tanto, es necesario definir el estado endémico del áreadonde se utilice.

Es necesario continuar con los estudios para aumentar la confiabilidad de laspruebas diagnósticas, como lo las técnicas de inmunoperoxidasaen placa y de avidina-biotina para tratar de disminuir los falsos positivos debidosal efecto de los glóbulos rojos presentes en los tejidos, incluso es necesarioevaluar el comportamiento de los anticuerpos en una población de animalesinfectados y animales vacunados durante todos los episodios de la enfermedad,fase de recuperación y reactivación del virus en diferentes zonaslecheras, para determinar la relación de los resultados con el comportamientode la enfermedad y determinar la mejor prueba para su diagnóstico.

Se agradece el apoyo del Centro Nacional de Servicios de Diagnóstico en Salud Animal (CENASA), y del laboratorio de Virología y Patología durante la elaboración práctica; asimismo, se reconoce la participación del Complejo Agropecuario e Industrial de Tizayuca (CAIT), Tizayuca, Hidalgo: Laboratorio de Patología y Diagnóstico, Sanidad Animal, por la obtención de las muestras.

COMPARISON BETWEEN THREE DIAGNOSTIC TESTS TO DETECT ABORTION CAUSED BY INFECTIOUS BOVINE RHINOTRACHEITIS IN DAIRY HERDS

Alfa Bracho Cárdenas*,** Carlos J. Jaramillo Arango** José Juan Martínez Maya**
Juan Antonio Montaño Hirose*** Arturo Olguín y Bernal**

* Este trabajo forma parte de la tesis de maestría del primer autor.
** Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Nacional Autónomade México, 04510, México, D. F.
*** Instituto de Ciencias Agropecuarias, Universidad Autónoma del Estadode Hidalgo, 43600, Tulancingo, Hidalgo, México.