INTRODUCCIÓN
La endometritis subclínica (ESC) es una enfermedad puerperal con alta prevalencia en los establos lecheros (1). Esta enfermedad repercute negativamente en el desempeño reproductivo porque reduce la tasa de concepción por servicio (1). Además, es una enfermedad difícil de diagnosticar a nivel de campo ya que requiere el uso de instrumental especializado o modificado y el uso de un microscopio. Las vacas con ESC se caracterizan por presentar altos conteos de neutrófilos polimorfonucleares (NPMN) en muestras citológicas endometriales (≥10%, (1)). Aunado a esto, se ha reportado que otras enfermedades puerperales, como la metritis y la endometritis clínica, son factores de riesgo para la ESC (2). La presencia de bacterias en el útero estimula la liberación de citocinas proinflamatorias en el endometrio que favorecen la migración de NPMN para combatir la infección (3). Estudios sugieren que la ESC se desarrolla a consecuencia de una mayor producción de citocinas proinflamatorias durante el control de la infección bacteriana en el útero (3). Por lo tanto, una estrategia para reducir la prevalencia de ESC pudiera ser disminuir la carga bacteriana uterina durante el posparto temprano. En relación con lo anterior, el ozono ha sido utilizado experimentalmente en la clínica de bovinos para tratar enfermedades puerperales, mastitis y problemas podales (4). Específicamente en las enfermedades puerperales, la terapia con ozono en forma de espuma aplicada por vía transcervical ha demostrado ser efectiva para tratar la metritis y endometritis clínica; efecto probablemente asociado con sus propiedades bactericidas (4). Aunado a esto, hay evidencia que sugiere que la terapia con ozono tiene la capacidad para regular la respuesta inmune (5). Por ejemplo, se ha reportado que el ozono aplicado en vías aéreas induce la expresión de factores quimiotácticos en el epitelio respiratorio incrementando el número de NPMN (5). Lo cual permite suponer que, además del efecto bactericida, el ozono pudiera estimular la expresión de factores quimiotácticos en el endometrio uterino incrementando el número de NPMN, sin embargo, este efecto en el útero aún no ha sido demostrado.
OBJETIVO
Determinar la capacidad de solución salina ozonizada (SSO3) para incrementar la cantidad de NPMN en la luz uterina y desafiar el efecto preventivo de esta terapia sobre la prevalencia de ESC.
MATERIALES Y MÉTODOS
El presente estudio se llevó a cabo en un establo comercial en el estado de Querétaro, entre los meses de agosto y octubre del 2019. Para alcanzar el objetivo se diseñaron dos experimentos; el experimento 1 para desafiar la capacidad de la SSO3 para incrementar el número de NPMN en la luz uterina y el experimento 2 para desafiar la capacidad de esta terapia para prevenir la ESC. Experimento 1. Se utilizaron 38 vacas Holstein de primera lactación. Se registró la presencia de vacas con metritis y endometritis clínica (diagnosticadas a partir de las características de las secreciones uterinas), mismas que recibieron tratamiento con antibióticos de amplio espectro (clasificadas como vacas con antecedentes de enfermedad, ENF). Como parte del manejo reproductivo del establo, a las vacas se les aplicó un programa de pre-sincronización que consistió en dos dosis de 25 mg de dinoprost trometamina a intervalo de 14 días. Trece días después de la segunda prostaglandina (vacas en etapa de diestro), entre los 50 y 60 días postparto, se tomó una biopsia (pretratamiento) de tejido endometrial mediante la técnica de citobrush. Posteriormente, se aplicaron por vía transcervical 50 ml de solución salina en el grupo control (CTRL) o SSO3 en el grupo tratado (5-6 ppm de ozono, determinado por titulación yodométrica), en vacas clínicamente sanas; vacas sin signos sistémicos de enfermedad, con útero involucionado a la palpación transrectal y sin la presencia de exudados que indicaran endometritis clínica. Las vacas con (ENF) y sin (SAN) antecedentes de enfermedades uterinas fueron distribuidas aleatoriamente entre los grupos que recibieron CTRL o SSO3. Cuarenta y ocho horas después de la aplicación del tratamiento, se tomaron nuevamente muestras (postratamiento) de tejido endometrial con la misma técnica. En ambas muestras (pre y postratamiento), se montaron laminillas que se analizaron al microscopio a 400x, se contabilizaron 200 células, y se registró la cantidad de neutrófilos polimorfonucleares. Las vacas que presentaron endometritis subclínica (≥10% NPMN) en la muestra pretratamiento fueron descartadas del estudio (una vaca). El análisis estadístico consistió en un análisis de varianza con un diseño completamente al azar con arreglo factorial (antecedentes de enfermedades puerperales (ENF o SAN) x tratamiento con solución salina (CTRL o SSO3). Para cumplir con los supuestos del análisis de varianza, la variable de respuesta (número de NPMN) fue transformada logarítmicamente (logY= log(Y+1)). Experimento 2. Se utilizaron 26 vacas de primera lactación de la raza Holstein. Las vacas se repartieron de forma aleatoria en dos grupos; control (solución salina 0.9%; CTRL) y tratamiento (solución salina ozonizada; 6-8ppm; SSO3). Utilizando pipetas de infusión, se administró de forma intrauterina, dos dosis de 50ml (con un intervalo de 7 días) de solución salina o de salina ozonizada. La primera dosis se administró entre los 7-14 días postparto. Las vacas incluidas en el estudio fueron animales clínicamente sanos, sin signos de metritis puerperal y sin antecedentes de aplicación de tratamientos para enfermedades puerperales. Al día 30 postparto se realizó el diagnóstico de ESC con la técnica de citobrush. Las vacas, cuyas muestras tuvieron ≥ 10% de neutrófilos polimorfonucleares en el análisis citológico, fueron diagnosticadas positivas a ESC (1). Para determinar si existieron diferencias entre el porcentaje de vacas con ESC se utilizó la prueba exacta de Fisher. Para determinar el riesgo que tuvo una vaca para desarrollar ESC se obtuvo la razón de momios a través de un análisis de regresión logística simple. Para ambos experimentos, se estableció un valor de P<0.05 como umbral de significancia estadística y un valor de P≤0.1 como indicador de tendencia.
RESULTADOS
Experimento 1. Los resultados se indican con las variables sin transformar para facilitar su interpretación. Dentro del grupo de vacas sin antecedentes de enfermedad puerperal (SAN), no hubo diferencias estadísticas (P=0.8) entre grupos CTRL y SSO3 (0.1±5.0 y 1.8±4.8, respectivamente). Dentro del grupo de vacas con antecedentes de enfermedad puerperal (ENF), tampoco hubo diferencias estadísticas (P=0.4) entre grupos CTRL y SSO3 (17.0±5.6 y 10.4±6.0). Sin embargo, comparando vacas dentro del grupo con solución salina (CTRL), las vacas con antecedentes de enfermedad puerperal (ENF) tuvieron mayor número de NPMN (17.0±6) comparado con las vacas del grupo sin antecedentes de enfermedad puerperal (SAN) (0.1±5) (P<0.05). Por otra parte, dentro del grupo de vacas con solución salina ozonizada (SSO3), no hubo diferencias estadísticas entre los grupos SAN y ENF (1.8±5 y 10.4±6, respectivamente; P=0.26). Experimento 2. El porcentaje de vacas con ESC al día 30 fue de 30.7%. Se observó una tendencia estadística (P=0.09) para diferencias en el porcentaje de vacas con ESC entre grupos CTRL y SSO3 (15.4 y 46.2%, respectivamente). El análisis de regresión logística indicó una tendencia estadística (P=0.1); las vacas que recibieron el tratamiento con ozono (SSO3) tuvieron 4.7 veces mayor riesgo (0.73-30.3, LC95%) de desarrollar ESC que las vacas que recibieron únicamente solución salina (CTRL).
DISCUSIÓN
En la literatura se reporta que los lavados intrauterinos con solución salina, a pesar de tener un efecto irritante, es un tratamiento efectivo para vacas con ESC (6). Esos protocolos consisten en aplicar lavados uterinos repetidamente y con volúmenes totales mayores a los utilizados en el presente estudio (500-600ml). Lo cual sugiere que existe un efecto mecánico que elimina los NPMN, así como las citocinas proinflamatorias presentes en el lumen uterino (6). Por otra parte, los resultados indicaron que en vacas sin antecedentes de enfermedades puerperales (y sin ESC), no hubo un incremento en el número de NPMN posterior a la aplicación de los tratamientos. Sin embargo, en vacas con antecedentes de enfermedades uterinas (también sin ESC), el número de NPMN fue mayor en vacas que recibieron solución salina (grupo CTRL) seguido por el grupo SSO3. Estos resultados sugieren que, en vacas con antecedentes de enfermedades uterinas, existe una mayor sensibilidad en el endometrio uterino para responder a la capacidad irritante de la solución salina (observado a través del incremento en el número de NPMN). Esta hipótesis es soportada por el hecho de que en vacas con ESC, cuando se les aplicó un volumen bajo de solución salina por vía intrauterina, el conteo de NPMN se observó incrementado en una segunda muestra tomada 10 días después (6).
Vale la pena destacar que cuando se aplicó SSO3 en vacas con antecedentes de enfermedades puerperales, el incremento en el número de NPMN no fue diferente estadísticamente al incremento observado en vacas sin antecedentes de enfermedades puerperales. Estos resultados sugieren que la SSO3 pudiera tener un efecto inmunomodulador a la baja, es decir antiinflamatorio, descartando parte de nuestra hipótesis de trabajo. Con relación a lo anterior, hay reportes que indican que la terapia con ozono en insuflaciones rectales ejerce un efecto antiinflamatorio sistémico (7). Los mecanismos a través de los cuales pudiera actuar el ozono para ejercer un efecto antiinflamatorio no han sido totalmente dilucidados, sin embargo, la estimulación directa de la terapia con ozono en la expresión de citocinas antiinflamatorias (IL10) es una hipótesis pendiente de desafiar.
Aunado a esto, los resultados del experimento 2 indican que las vacas que recibieron el tratamiento con SSO3 tuvieron mayor prevalencia y mayor riesgo de sufrir ESC. Una explicación a estos resultados radica en la posible capacidad de la SSO3 para disminuir la respuesta inmune a través de la expresión de citocinas antiinflamatorias. Se sabe que la presencia de bacterias en la luz uterina estimula la expresión de citocinas proinflamatorias que favorecen la migración de NPMN para combatir la infección (3). Además, estudios recientes sugieren que un incremento en la cantidad de citocinas proinflamatorias predispone al desarrollo de ESC (3). Por otra parte, si el tratamiento con SSO3 incrementa la expresión de citocinas antiinflamatorias (IL10), la respuesta inmune pudo verse inicialmente disminuida, induciendo a una infección uterina más grave. Posteriormente, esta infección uterina pudo haber estimulado una respuesta inmune aún más agresiva, predisponiendo así a un mayor riesgo en las vacas de desarrollar ESC.
CONCLUSIONES
La SSO3 no incrementa la migración de NPMN en la luz uterina y no tiene un efecto preventivo para el desarrollo de ESC. Los resultados de este estudio sugieren que la SSO3 pudiera tener un efecto antiinflamatorio.
AGRADECIMIENTOS
Al Fondo para el Fortalecimiento a la Investigación (FOFI) FNV201809 de la Universidad Autónoma de Querétaro por el financiamiento de este proyecto.
