Aislamiento de un bacteriofago litico de staphylococcus aureus de un establo lechero de Mexicali Baja California
Publicado: 16 de febrero de 2018
Por: N.E. Díaz Vargas*, G. Felipe García, J. Brisuela Raygosa, J. Palacios Torres, G. E. Medina Basulto, S. Hori-Oshima** Instituto de Investigaciones en Ciencias Veterinarias - UABC
Resumen
Staphylococcus aureus es el principal agente causante de mastitis bovina, provocando grandes pérdidas económicas en establos lecheros. El objetivo del presente trabajo fue aislar nuevos bacteriófagos líticos capaces de infectar y destruir S. aureus. A partir de muestras fecales de 6 vacas en el establo del IICV-UABC, se aisló un fago lítico (NVøSA54), el cual se caracterizó por producir calvas pequeñas, totalmente transparentes y sensible al CHCl3. El análisis del rango de huésped resultó con 4 aislados sensibles (14.3%) de un total de 28 aislados, provenientes de distintas regiones de Baja California y Baja California Sur. Las dos cepas de referencia y aislados de otras 4 especies bacterianas fueron resistentes al fago. Es importante continuar la búsqueda de fagos líticos con un mayor rango de huésped y mayor actividad lítica para su aplicación posterior como tratamientos alternativos y el control biológico del S. aureus, particularmente de las cepas multidrogo resistentes.
Introducción
En animales de producción, Staphylococcus aureus es uno de los principales agentes etiológicos de mastitis provocando pérdidas económicas muy graves para los productores (Bradley, 2002). Los tratamientos convencionales fracasan con frecuencia en la eliminación de la enfermedad debido al desarrollo de resistencia a antibióticos por parte del patógeno (Pahissa, 2004). En el estudio reciente por nuestro grupo de investigación aproximadamente 74% de aislados de S. aureus asociados a mastitis bovina en Baja California se caracterizaron como Multidrogo Resistente (MDR) (Palacios, 2014).
Los bacteriófagos o fagos son virus que infectan exclusivamente a bacterias, y juegan un papel muy importante en la regulación del balance del ecosistema microbiano (Kutter y Sulakvelidze, 2005). El ciclo de vida de fagos se divide en dos fases; el ciclo lítico y lisogénico. En el ciclo lítico la bacteria infectada por un fago muere por rotura o lisis liberando cientos partículas de fagos replicados, mientras en el ciclo lisogénico el genoma del fago se integra en el genoma bacteriano formándose el profago, o lisógeno, sin que produjera nuevos fagos. En los últimos años se ha incrementado el interés hacia los fagos líticos como una herramienta para el control biológico de los patógenos bacterianos. Se han reportado aislamientos de nuevos fagos líticos capaces de lisar a distintas cepas de S. aureus asociados a mastitis en animales, a partir de muestras de animales y del ambiente (Son y col. 2010, Kwiatek y col. 2011).
El objetivo del presente trabajo fue aislar y caracterizar nuevos bacteriófagos líticos que infectan a cepas de S. aureus asociados a mastitis bovina en Baja California.
Materiales y métodos
Cepas bacterianas: Se utilizaron 2 cepas de referencia de S. aureus (ATCC 33591 y ATCC BAA1026) y 28 aislados de S.aureus provenientes de diferentes municipios de Baja California y Baja California Sur (Cuadro 1). Todos los aislados de S. aureus se caracterizaron como múltidrogo resistentes (MDR). Para el análisis del rango de huésped se incluyeron 4 aislados de Staphylococcus cromogenes, E. coli, Klebsiella spp., y Enterobacter spp.
Muestreo y procesamiento: Se utilizó una mezcla de heces frescas de 6 vacas del establo lechero del IICV-UABC como la fuente de fagos líticos. Se empleó la estrategia de preamplificación para aumentar la cantidad de fagos líticos presentes en la muestra inicial (Kutter E., Sulakvelidze A., 2005). En breve, se suspendieron 15 gr de heces en 40 ml de agua destilada, y se sedimentaron partículas y residuos por 30 min a temperatura ambiente. Se centrifugó la fase superior a 8,000 g por 10 min y al sobrenadante se agregó con el mismo volumen del medio de cultivo LB (2×) suplementado con 2mM de CaCl2. Se inoculó con 100 µl de una cepa de la bacteria hospedera (ATCC 33591, ATCC BAA1026, o aislado 54A) de la fase del crecimiento exponencial, y se incubó durante toda la noche a 37ºC con agitación por 50 rpm. El siguiente día se recuperó el sobrenadante por centrifugación a 8,000 g por 10 min y se almacenó a 4 °C hasta la prueba de la actividad lítica.
Aislamiento y caracterización de fagos: Para la prueba de la actividad lítica se realizó el ensayo de la gota (Clokie y Kropinski, 2009), colocando 5-10 µl de sobrenadante sobre el inóculo de la bacteria hospedera en agar base de LB con 1 mM de CaCl2. Para aislar fagos líticos se realizó el ensayo de doble capa para evidenciar la presencia de calvas (= zonas claras en la capa del agar blando debido a la lisis de la bacteria, representando la multiplicación de un fago original). Se realizó la amplificación, purificación, y determinación del título de fagos aislados con el método convencional del lisado de placa y el ensayo de doble capa (Clokie y Kropinski, 2009) obteniendo fagos purificados suspendidos en la solución SM (100 mM NaCl, 10 mM MgSO4, 50 mM Tris-HCl, pH 7.5, gelatina 0.01% w/v). Para verificar la tolerancia a CHCl3 se añadió CHCl3 al 1% y se dejó por 2 h a 4 ºC. Se caracterizó el rango de huésped del fago mediante la prueba de gota utilizando cepas y aislados del Cuadro 1.
Resultados y discusión
La pre-amplificación de muestras fecales con las dos cepas de referencia, ATCC 33591 y ATCC BAA1026, resultó negativo en el ensayo de gotas. La pre-amplificación con el aislado 54A, proveniente del establo lechero del IICV resultó positivo en el ensayo de gota con zonas claras en el inóculo de la bacteria, indicando la presencia de actividad lítica (Figura 1).
Figura 1. Actividad lítica del fago NVøSA54 contra S. aureus.
En la Figura 1, la parte izquierda demuestra el aislado 54A inoculado en tres líneas con apariencia de múltiples zonas de lisis redondas y transparentes, debido a la presencia de fagos líticos. En la parte derecha se observan tres líneas del aislado 54B, sin lisis. En el ensayo de doble capa se observaron calvas muy pequeñas (< 1mm de diámetro) con el límite muy claro regular en menos de 24 h. Se logró aislar solo un tipo de fago, denominado NVøSA54, obteniendo un título de 6×109 pfu/ml (pfu: unidad de formadoras de calvas). El fago NVøSA54 no demostró tolerancia al CHCl3, lo cual nos impide el uso de CHCl3 durante el almacenamiento del fago, aumentando el riesgo de contaminación microbiológica. La sensibilidad de los fagos al CHCl3 se explica comúnmente por el alto contenido de lípidos en la cápside de los fagos (Kutter y Sulakvelidze, 2005).
Utilizando 2 cepas de referencia y 28 aislados de S.aureus originarios de vacas con mastitis en Baja California y Baja California Sur, se determinó el rango de huésped del NVøSA54 (Cuadro 1). Ambas cepas de referencia fueron resistentes al fago. En total 4 aislados fueron susceptibles (13.3%, 4/30) incluyendo el huésped inicial 54A. La especificidad del reconocimiento del huésped fue muy alta pudiéndose diferenciar dos aislados de la misma vaca del establo del IICV (Figura 1., 54A y 54B), pero no está limitada por la ubicación geográfica del origen de aislados. Utilizar una mezcla de aislados de distintas regiones como huésped en la pre-amplificación pudiera aumentar la probabilidad de obtener otros fagos líticos con el mayor rango de huésped.
Kwiatek y col. (2012) aislaron y caracterizaron nuevo bacteriófago lítico (MSA6) de la familia Myoviridae, el cual muestra amplio espectro de la infectividad a aislados de S.aureus de origen animal y humano. Son y col. (2010) aislaron dos bacteriófagos líticos (SAP-1 y SAP-3) específicos a S. aureus asociados a mastitis bovina a partir de muestras del ambiente del establo lechero. El rango de huésped de estos fagos fue muy reducido, observando la susceptibilidad de 1 o 2 aislados para cada fago. SAP-1 y SAP-3 no lisaron ninguna cepa de referencia de S.aureus ni otras especies de bacterias analizadas, como el caso de NVøSA54, el cual no mostró la actividad lítica a aislados locales de otras especies bacterianas, Staphylococcus chromogenes, E. coli, Klebsiella spp., Enterobacter spp (datos no incluidos en el Cuadro 1).
En este estudio se logró aislar nuevo fago de S. aureus con actividad lítica a aislados asociados a mastitis bovina, con un rango de huésped relativamente pequeño. Es importante buscar fagos líticos con mayor rango de huésped, particularmente de cepas MDR para la aplicación terapéutica y control biológico.
Cuadro 1. Rango de huésped del fago NVøSA54
Literatura citada
Bradley, A. 2002. Bovine mastitis: an evolving disease. Vet. J. 164: 116-28.
Clokie M.R.J. and Kropinski A. M. 2009. Bacteriophages: Methods and Protocols, Human Press, New York, NY.
Kwiatek, M., S. Parasion, et al. 2012. Characterization of a bacteriophage, isolated from a cow with mastitis, that is lytic against Staphylococcus aureus strains. Arch. Virol. 157: 225-34.
Kutter E., Sulakvelidze A. 2005. Bacteriophages: Biology and Applications, CRC Press, Florida, USA.
Pahissa A. 2009. Infecciones producidas por Staphylococcus aureus (1ra ed.). ICG Marge SL, Barcelona, España.
Palacios Torres J. 2014. Caracterización genética de aislados de Staphylococcus aureus obtenidos de casos de mastitis en establos lecheros de Baja California, México. Tesis de Maestría. Instituto de Investigaciones Ciencias Veterinarias, Universidad Autónoma de Baja California. México.
Son J.S., Kim E.B., Lee S.J., Jun S.Y., Yoon S.J., Kang S.H., Choi Y.J. 2010. Characterization of Staphylococcus aureus derived from bovine mastitis and isolation of two lytic bacteriophages. J. Gen. Appl. Microbiol. 56: 347-353.
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Universidad Autónoma de Baja California (UABC)
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