Producción de embriones transgénicos bovinos por microinyección de un vector lentiviral pre y pos fertilización.

NTRODUCCIÓN

Los organismos genéticamente modificados (OMG) o transgénicos son aquellos que por acción del hombre tienen secuencias de ADN de otra especie en su genoma [¹]. El gen que se introduce o transgén, consiste en una construcción que contiene las regiones promotora y codificadora de una proteína de interés, que puede ser de otro animal de la misma especie de una bacteria o planta [²].

Existen varias metodologías para generar animales transgénicos, entre ellas la microinyección pronuclear [³], transferencia de ADN mediada por espermatozoides, transferencia nuclear a partir de células somáticas transfectadas (SCNT) [⁴], microinyección de ADN pronuclear [⁵^,⁶], CRISPR/Cas9 [⁷], microinyección de transposones [⁸], vectores retrovirales [⁹] y nucleasas efectoras tipo activadoras de la transcripción [¹⁰], las cuales varían en eficiencia [¹].

Cuando se usan vectores retrovirales, los lentivirus son los más utilizados [⁹]. Estos vectores se obtienen reemplazando los genes virales gag, pulg y env por uno o más genes, mientras que, el conjunto de genes reguladores necesarios para la encapsulación (secuencia ψ), la transcripción reversa (PBS, R, PPT) y la expresión de los genes (LTR) se conservan [⁹^,¹¹]. Así mismo, el transgén más utilizado, debido a que muestra una expresión estable en células de mamíferos y a que se puede rastrear in situ de forma cuantitativa o cualitativa y no invasiva [¹²] es de la proteína fluorescente verde (eGFP) derivada de la medusa Aequorea Victoria [¹³].

Los primeros animales transgénicos generados utilizando la tecnología de vectores lentivirales se desarrollaron a partir de la microinyección de un vector lentivial derivado del virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1) en el espacio perivitelino de ovocitos fertilizados [¹⁴]. Luego, la comparación de la técnica microinyección de ADN clásica, con la transferencia de genes en un vector lentiviral resultó en una tasa de cuatro a ocho veces más elevada [¹⁵]. Hoy, la técnica se ha masificado a diferentes animales [⁸], aunque, todavía existen algunas limitaciones en la utilización de lentivirus, especialmente cuando se hace necesario el uso de altos títulos virales, pues el lentivirus debe sobrepasar la zona pelúcida (ZP) del embrión y la matriz extracelular glicoprotéica que confiere protección externa al embrión [¹⁶] incluso contra agentes infecciosos [¹⁷]. Así, la ZP acaba actuando como una barrera física que evita la penetración del lentivirus [¹⁶]. Por lo tanto, el método preferido para la inyección de partículas virales, es dentro del espacio perivitelino (inyección subzonal) permitiendo que el virus consiga superar la membrana del ovocito o el cigoto, lo que hace necesario el uso equipos sofisticados para inyección subzonal [¹⁶].

Finalmente, los animales transgénicos pueden ser utilizados para la producción de proteínas humanas recombinantes, xenotransplantes, en el estudio in vivo de la función de un gen durante la organogénesis, el desarrollo y el envejecimiento, la generación de modelos experimentales en animales para el conocimiento de los mecanismos involucrados en el desarrollo de enfermedades, así como el estudio de estrategias terapéuticas en modelos de enfermedades y en el sector productivo, esta técnica atiende a programas de mejoramiento genético con rápida multiplicación de animales con características deseables e interés económico [⁹^,¹⁸^-²⁰].

En este contexto, el objetivo fue comparar la eficiencia de la microinyección de un vector lentiviral que lleva el gen eGFP en ovocitos maduros (PRE-fertilización) y cigotos seis horas después de la fecundación (POS-fertilización).

METODO

Colecta de los ovarios y manipulación de los ovocitos

Fueron utilizados 720 ovarios colectados de hembras bovinas, sin definir la raza en diferente fase del ciclo estral, sacrificada en frigorífico localizado en la ciudad de Juiz de Fora, Minas Gerais, Brasil. Inmediatamente después del sacrificio y la evisceración, los ovarios fueron removidos e inmersos en nevera térmica con solución fisiológica (0,9% NaCl) suplementada con sulfato de estreptomicina (0,05 g/L), a temperatura entre 35 y 38°C. Al terminar la colecta, los ovarios fueron transportados al laboratorio de reproducción animal de la Universidad Federal de Viçosa en un tiempo máximo de 30 min. Los ovarios fueron lavados con solución fisiológica, previamente colocada en baño de maría a 37°C, los folículos ováricos (≤10 mm) fueron succionados con jeringa. El líquido folicular fue depositado en cáliz cónico, a temperatura de 37°C. Una vez ocurrida la decantación de los ovocitos, éstos fueron almacenados en medio Talp-Hepes y luego clasificados morfológicamente [²¹]. Sólo los ovocitos inmaduros con células del cumulus compacto y con al menos tres capas de células se transfirieron a una placa de Petri que contenía medio Talp Hepes, y posteriormente utilizados en los procedimientos experimentales.

Maduración in vitro (MIV)

Se utilizaron 1777 ovocitos madurados en medio TCM 199 (Tissue Culture Medium 199) (Gibco/Invitrogen) suplementado con FSH (Hormona Folículo Estimulante) (20 mcg/ml) y suero de vaca en celo (10%). La maduración se realizó en grupos de 50-60 estructuras, depositadas en placas Nunc (Thermo Scientific, Cat.176740) de cuatro pozos, conteniendo 400 μL de medio de maduración previamente equilibrado por al menos dos horas en incubadora de cultivo celular a 38,5°C con atmósfera de 95% de humedad y 5% de CO2. Los ovocitos se cultivaron en estas condiciones de temperatura y atmósfera durante 22 a 24 horas. Después de haber sido madurados, fueron distribuidos en los respectivos tratamientos.

Tratamientos

Los ovocitos madurados fueron distribuidos en siete tratamientos. El tratamiento 1 (T1) correspondió al control (n=577). Los restantes 1200 ovocitos fueron distribuidos en dos grandes grupos experimentales, identificados como T2_PRE, T3_PRE y T4_PRE, los cuales fueron microinyectados antes (PRE) de la fertilización in vitro (n=600) y T2_POS, T3_POS y T4_POS los cuales fueron microinyectados después (POS) de la fertilización in vitro (n=600).

T1 = Control (n=577). Fecundados in vitro con complejos cumulus-oócito (CCOs) con una concentración de 1x10⁶ espermatozoides (SPTZ)/mL, cultivados en medio CR2 enriquecido con 10% de SFB e incubados a 38,5°C en atmosfera de 95% de humedad y 5% de CO2.

T2 _PRE= Control de medio de cultivo (n=200). Células del cumulus removidas por vórtex en presencia de hialuronidasa, fecundados in vitro con una concentración de 1x10⁶ SPTZ/mL, cultivados en medio SOF en saches de aluminio con una mezcla de gases de 5% de CO2, 5% de O2 y 90% de N2 y humedad saturada a una temperatura de 38,5°C.

T2 _POS= Control de medio de cultivo (n=200). Fecundados in vitro con una concentración de 4x10⁶ SPTZ/mL durante 6 h, cultivados en medio SOF en saches de aluminio con una mezcla de gases de 5% de CO2, 5% de O2 y 90% de N2 y humedad saturada a una temperatura de 38,5°C.

T3 _PRE= Control de microinyección (n=200). Células del cumulus removidas por vórtex en presencia de hialuronidasa, microinyectados con medio TALP y seguidamente fecundados in vitro con una concentración de 1x10⁶ SPTZ/mL y cultivados en las mismas condiciones del tratamiento T2_PRE.

T3 _POS= Control de microinyección (n=200). Fecundados in vitro con una concentración de 4x10⁶ SPTZ/mL y cultivados en las mismas condiciones del tratamiento T2_POS. Pasadas las 6 h de tiempo de fecundación fueron microinyectados con medio TALP y cultivados en saches con las mismas condiciones del tratamiento T2_POS.

T4 _PRE= Microinyectados con el lentivirus (n=200). Células del cumulus removidas por vórtex en presencia de hialuronidasa microinyectados con el vector lentiviral y seguidamente fecundados in vitro con una concentración de 1x10⁶ SPTZ/mL y cultivados en las mismas condiciones de los tratamientos T2_PRE y T3_PRE.

T4 _POS= Microinyectados con el lentivirus (n=200). Fecundados in vitro con una concentración de 4x10⁶ SPTZ/mL y cultivados en las mismas condiciones del tratamiento T2_POS. Pasadas las 6 h de tiempo de fecundación fueron microinyectados con el vector lentiviral y cultivados en saches con las mismas condiciones del tratamiento T2_POS y T3_POS.

Vector lentiviral

El vector lentiviral fue producido por transfección transitoria, utilizando cuatro plásmidos: el plásmido de empaque (pMDLg/pRRE), el que codifica para la proteína de envoltura (pMD2.G), el plásmido que codifica para la proteína Rev (pRSV-Rev) (Addgene, EE.UU.) y el plásmido que contiene el transgén (pLGW).

Se utilizó el linaje celular HEK-293F (ATCC CRL 1573) cultivadas en medio DMEM más 10% de SFB hasta alcanzar el estado de 80% de confluencia. La transfección con los vectores lentivirales se realizó con una mezcla que contenía los cuatro plásmidos, en concentració de 6 μg de ADN de cada uno de los plásmidos estructurales (pMDLg/pRRE, pMD2.G y pRSV-Rev) y 12 μg del plásmido de interés (pLGW).

Se prepararon dos mezclas por separado: una mezcla de polietilenoimina 18 mM (PEI, Sigma) más glucosa al 5% y otra mezcla de ADN plasmidial más glucosa al 5%. Se utilizó la relación de 1 μL de PEI (con pH ajustado a 7) por cada 1 μg de ADN. Las dos mezclas fueron sometidas a agitación en vórtex durante un minuto y dejadas en reposo por 5 min, luego ambas mezcladas y puestas en agitación vigorosa en vórtex, todo el contenido se mantuvo en reposo durante 10 min, tiempo durante el cual se efectuó un nuevo intercambio de medio sin SFB. Se agregó 1 mL de DMEM sin SFB a la mezcla y, después de la homogeneización, todo el contenido se añadió a la botella de cultivo. Después de 6 h de transfección se añadió SFB al medio para obtener la concentración del 10%. Después de 48 h el medio de cultivo fue centrifugado por 25000 rpm durante 1,5 horas a 4ºC. El pellet de lentivirus se resuspendió en 100μL de DMEM sin SFB y congelado a -80ºC hasta su utilización [¹²^,²³].

Microinyección de los ovocitos PRE-fertilización (T3 _PRE y T4 _PRE )

Después de la MIV, las células del cumulus fueron removidas de los ovocitos por adición de 0,1% de hialuronidasa en agitación mecánica en vórtex por 5 min. A continuación, los ovocitos desnudos fueron lavados con medio TALP-Hepes y vertidos en placa de Petri para recuperación de los mismos. La evaluación de la maduración nuclear de los ovocitos fue hecha por la observación del corpúsculo polar utilizando estereoscopio (Nikon SMZ 645). Los ovocitos fueron nuevamente lavados en medio TALP y mantenidos en gotas de 20 μL del medio cubierto con aceite mineral hasta el momento de la microinyección.

La inyección del medio TALP (T3_PRE) y con el vector lentiviral (T4_PRE) en el espacio perivitelíneo (subzonal) fue realizada por la observación directa en microscopio invertido (Axiovert 135M, Carl Zeiss) equipado con un sistema de micromanipulación hidráulica (Nikon Narishige NT-88V3), conectado a un sistema de microinyección. Los ovocitos fueron inmovilizados con la pipeta de fijación y, con la micro-aguja cargada, se procedió a la microinyección subzonal con el medio TALP o con la solución que contenía el vector lentiviral, según correspondiera. Durante la manipulación, la zona pelúcida se expandió inmediatamente, y la microinyección fue considerada exitosa cuando la zona pelúcida creció visiblemente. Después de la inyección del TALP o del lentivirus subzonal, los ovocitos fueron lavados tres veces en medio TALP y nuevamente transferidos al medio TCM.

Microinyección de los ovocitos POS-fertilización (T3 _POS y T4 _POS )

Después de las 6 h del inicio de la FIV, los supuestos cigotos fueron retirados de la gota de fecundación y sometidos a remoción completa de las células del cumulus por agitación mecánica en vórtex por 5 min y luego transferidos a la placa de Petri. Los supuestos cigotos fueron lavados con medio TALP y mantenidos en gotas de 20 μL del medio cubierto con aceite mineral hasta el momento de la microinyección. La inyección del medio TALP (T3_POS) y el vector lentiviral (T4_POS) en el espacio perivitelíneo (subzonal) fue realizada como se describió para los tratamientos PRE. Después de la inyección del TALP o del lentivirus subzonal, los supuestos cigotos fueron lavados 3 veces en medio TALP y nuevamente transferidos al medio correspondiente. Durante este período, los ovocitos de los tratamientos controles (no microinyectados) permanecieron en el medio FERT-TALP hasta completar 20 h de fecundación.

Cultivo in vitro de los embriones (CIV)

Después de la fertilización, los presumibles cigotos fueron retirados de la gota de fecundación, lavados en medio TALP-HEPES, y divididos en dos placas de cultivo. En el tratamiento T1 los supuestos cigotos fueron sometidos al desnudamiento con ayuda de un pipeteador y lavados en medio TALP. El cultivo fue efectuado en gotas de 50 μL de medio CR2 más el 10% SFB bajo aceite mineral, distribuidos en placas de Petri de 10x35 mm. El cultivo fue realizado en incubadora de cultivo celular a 38,5°C, 5% de CO₂ y humedad relativa del 95% [²⁴]. El CIV de los demás tratamientos fue realizado en placas de cuatro pozos tipo Nunc que contenía 500 μL de medio SOF suplementado con 2,5% de SFB, bajo aceite mineral, en grupos de 30-40 estructuras en cada pocillo. Durante todo el cultivo, las placas conteniendo los embriones se colocaron bolsa hermética (Sachet de Aluminio) que contenían una mezcla gaseosa de 5% de CO2, 5% de O2 y 90% de N₂ y humedad saturada, mantenidas a una temperatura de 38,5°C.

Evaluación del desarrollo embrionario y de la expresión del eGFP

La tasa de producción blastocistos fue evaluada al día octavo de cultivo (D8) utilizando estereoscopio (Nikon SMZ 645), siguiendo los parámetros descritos por la sociedad internacional de transferencia de embriones [²⁵]. La evaluación de la expresión del eGFP fue realizada visualmente, en blastocistos al D8, por medio de la exposición a la luz blanca y ultravioleta en estereomicroscopio (Nikon, SMZ800, filtro de 450-490 nm) o microscopio de fluorescencia (Motic, BA400, filtro de 465- 495 nm). En los blastocistos microinyectados con el vector lentiviral se anotó la posición relativa de la presentación de la fluorescencia.

Análisis estadístico

Las tasas de producción blastocistos en cada tratamiento fueron evaluadas bajo un modelo experimental medidas repetidas así (ecuación 1):

Donde: Y _ijes la tasa de producción de blastocistos al D8 y la tasa de producción de embriones transgénicos en los tratamientos T4_PRE y T4_POS, µ es el efecto del promedio, (_i es el efecto del i-ésimo tratamiento (T1, T2_{PRE y POS}, T3_{PRE y POS} y T4_{PRE y POS}), (_ij es el efecto del error asociado al embrión, p _kes el efecto k-ésimo periodo (1 al 5), ( τρ) ik es el efecto de la interacción tratamiento ((_i) por periodo (p_k) y (_ijk es el error experimental.

Los promedios de cada tratamiento fueron comparados por con el test de Ducan al 5%. Los análisis fueron realizados usando el programa StatPlus:mac v.6.

RESULTADOS

Las tasas de producción de blastocistos encontrados al D8 en el T1 y para los tratamientos PRE (T2_PRE, T3_PRE y T4_PRE) y POS (T2_POS, T3_POS y T4_POS) se presentan en el cuadro 1.

La mayor tasa de formación de blastocistos se encontró en T1, posiblemente debido a que este grupo no fue sometido a la manipulación de remoción de las células de los cúmulos y además permanecieron por 20 h en incubación con los espermatozoides durante el proceso de FIV.

Respecto a los tratamientos PRE-fertilización, se encontró que las tasas de blastocistos entre T1 (20,2%) y T2_PRE (16,5%) (p>0,05) confirman que las condiciones atmosféricas y el medio de cultivo utilizado no interfieren con la producción de blastocistos. Así, las variaciones encontradas pueden ser atribuidas al desarrollo propio de los embriones [¹⁸, ²¹^,²²]. La tasa de producción de blastocistos entre T2_PRE y T3_PRE no varió (p>0,05), lo anterior sugiere que el método de microinyección utilizado en esta investigación, que incluye la perforación de la zona pelúcida, no causa daño ni afectan el desarrollo embrionario (Cuadro 1).

Cuadro 1 Tasa y porcentaje de producción de blastocistos en cada tratamiento al día ocho (D8).

Producción de embriones transgénicos bovinos por microinyección de un vector lentiviral pre y pos fertilización. - Image 2

^A,B promedios en la misma columna sin letra común diferen estadísticamente (p<0,05). Solo incluye los tratamientos PRE y POS. ^a,b promedios en la misma fila sin letra común son diferen estadísticamente (p<0,05). Incluye al (T1)

Al igual que lo encontrado en los tratamientos PRE-fertilización, en el T2_POS los blastocistos producidos fueron menos respecto al T1, pero sin desviaciones significativas (p>0,05) lo que confirma que las condiciones de CIV no afectaron la producción de blastocistos al D8 [²²]. Así mismo, la cantidad de blastocistos formados en los tratamientos T2_POS y T3_POS, sugieren que la microinyección que incluye la perforación de la ZP no causa daño embrionario.

La comparación entre los tratamientos PRE (T2_PRE y T3_PRE) y POS (T2_POS - T3_POS) no mostró diferencias estadísticas en la producción blastocistos (p>0,05). A pesar de la manipulación a la que fueron sometidos los posibles cigotos de los tratamientos T2_POS y T3_POS, ya que 6 h después del inicio de la FIV, fueron retirados de la gota de fecundación y sometidos a la remoción completa células de cumulus. Este procedimiento es necesario para permitir el proceso de micromanipulación que se realiza durante la microinyección del lentivirus.

Solo el 5,5% de los oocitos del T4_PRE y el 3,5% del T4_POS se desarrollaron hasta blastocisto al día ocho (Cuadro 1), estos porcentajes difirieron (p<0,05) de los tratamientos T1, PRE (T2_PRE y T3_PRE) y POS (T2_POS y T3_POS), sugiriendo, que la tasa de producción de blastocistos estuvo influenciada por la presencia del vector lentiviral, cuando este fue microinyectado antes y después de la fertilización.

Los primeros estudios utilizando vectores lentivirales microinyectados en cigotos presentan una mayor eficiencia que los resultados aquí presentados. La inyección de vectores lentivirales en el espacio perivitelino de cigotos de bovinos logró que entre el 21% [²⁶] y el 22% [¹⁵] de los cigotos infectados se desarrollaron hasta el estadio de blastocistos.

En otras especies, las tasas de formación de blastocistos son 76% en embriones de macacos [²³] y en cerdos se reporta una tasa 25% [²⁷]. Se ha argumentado que, esta menor tasa de producción de blastocistos en bovinos, sea posiblemente debido a que el genoma lentiviral no es capaz de penetrar de forma eficiente en el pronúcleo bovino [¹²].

La comparación entre la producción de blastocistos transgénicos se presenta en el Cuadro 2.

Cuadro 2 Tasa y porcentaje de producción de blastocistos (D8) y de embriones transgénicos en los tratamientos T4_PRE y T4_POS.

Producción de embriones transgénicos bovinos por microinyección de un vector lentiviral pre y pos fertilización. - Image 3

^A,B promedios en la misma columna sin letra común diferen estadísticamente (P<0,05).

En el tratamiento T4_PRE el 100% de los blastocistos producidos al día ocho expresaron el transgén de interés (eGFP), mientras que, solo el 71,4% de los blastocistos producidos en el T4_POS expresaron la proteína eGFP (p<0,05).

Los resultados indican que la microinyección del vector lentiviral antes de la fertilización in vitro es más eficiente que la microinyección después de la fertilización in vitro. En este sentido, se debe considerar la influencia de la fase del ciclo celular y del estado de la cromatina sobre la integración de retrovirus. Al respecto, la penetración espermática durante la fecundación in vitro inicia con 4 h de cultivo, la formación de los pronúcleos se inicia a las 4 h y dura hasta 11 h, mientras que la síntesis de ADN (fase S) se inicia entre las 14 a 15 h después de la fertilización con una duración de 8 a 10 h [²⁶^,²⁷]. Algunos retrovirus, como el VIH, pueden integrarse en células que no estén en fase de división celular, pero la cromatina descondensada puede facilitar el acceso y la integración correcta del genoma viral [²⁸^,²⁹]. Este puede ser una de las razones por las cuales el uso de los vectores en ovocitos madurados, seguidos de la fecundación es más eficiente [¹²^,³⁰]. Adicionalmente, es probable que, en los cigotos bovinos, la integración lentiviral se podría retrasar significativamente en presencia de una membrana nuclear, también, que la infección retroviral puede retrasar el clivaje de los embriones, disminuyendo así la capacidad de integración del complejo de pre-integración [¹⁵]. También, se ha sugerido que la cantidad de títulos lentivirales usados durante la microinyección tengan un posible efecto deletéreo en la expresión de genes involucrados en el desarrollo embrionario [²³] y a los procesos de metiliación del ADN que regulación de la expresión génica [³¹] como posibles aspectos negativos que interfieren en el desarrollo embrionario.

La posición relativa, de expresión de la proteína eGFP en los tratamientos T4_PRE y T4_POS fue evidenciada en el trofectoderma así como en la masa celular interna del blastocisto (Figura 1), confirmando que, los métodos de microinyección del lentivirus son eficientes para la incorporación de un fragmento de ADN en el genoma oocitario.

La expresión de la proteína eGFP fue más alta a la reportada al microinyectar vectores lentivirales en cigotos de bovinos (45%) [²⁷]. En otras especies, en cerdos la expresión de la proteína eGFP fue del 65% [²⁷], mientras que, utilizando vectores lentivirales desarrollados a partir del genoma de la anemia infecciosa equina (AIE), se obtuvo un 31% de animales transgénicos a partir de cigotos inyectados con virus en el espacio perivitelino y el 95% de los animales fundadores exhibiendo fluorescencia verde [³²]. En ovinos, se reporta una producción del 97,4% de embriones transgénicos [¹²] y en ratones, los reportes varían entre el 90% [¹⁴] al 95,5% [³³] en la expresión del eGFP.

Producción de embriones transgénicos bovinos por microinyección de un vector lentiviral pre y pos fertilización. - Image 4

Figura 1 Expresión de la proteína eGFP en embriones bovinos en el estadio de blastocisto al día ocho microinyectados con un vector lentiviral. A y B corresponden al T4_PRE. C y D corresponden al T4_POS. Micrografía de campo claro (A y C) y de campo oscuro (B y D) expuestos a la radiación ultravioleta, estereomicroscopio (Nikon, SMZ800, filtro de 450-490nm).

La expresión de la proteína eGFP puede ser una herramienta para resolver preguntas en la biología del desarrollo embrionario. Se puede utilizar para estudiar las modificaciones epigenéticas, tales como la metilación del ADN, estudio de los procesos biológicos, ya que permite una visualización precisa de la estructura anatómica de los animales transgénicos expresando gen (eGFP), con el fin de obtener una visualización real del órganos y tejidos in vivo, también para estudiar las interacciones materno-embrionaria [¹⁰].

El método aquí utilizado surge como alternativa para modificar genéticamente animales de una forma más segura, rápida y rentable [¹²] cuando se compara por ejemplo con la microinyección pronuclear de ADN [¹⁶^,³⁴], en parte, porque se ha demostrado que a diferencia de los retrovirus simples, los lentivirus no puede activar proto-oncogenes por su inserción, también, porque el uso de títulos elevados de vectores lentivirales no necesita altos confinamientos de bioseguridad debido al bajo volumen usado durante las microinyección [¹²^,¹⁶].

CONCLUSIONES

Las condiciones de cultivo utilizadas y el método de microinyección del vector lentiviral fueron adecuadas, ya que no se encontraron diferencias significativas en la producción de blastocistos entre los tratamientos T1 y los tratamientos PRE (T2_PRE y T3_PRE) y POS (T2_POS y T3_POS).

El vector lentiviral influyó en el desarrollo embrionario, deducido a partir de que el porcentaje de blastocistos encontrado en T4_PRE y T4_POS.

La expresión del transgén en los cigotos producidos fue alta, indicando que las técnicas aquí empleadas (PRE y POS fertilización) son altamente eficientes para la obtención de animales transgénicos al compararse con los reportes de la literatura.

La inyección PRE fertilización resultó mayor tasa (p<0,05) de producción embriones transgénicos.

Producción de embriones transgénicos bovinos por microinyección de un vector lentiviral pre y pos fertilización.

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