Mannheimiosis bovina: etiología, prevención y control

Introducción

Entre las enfermedades infecciosas que afectan al ganado bovino, las de origen respiratorio constituyen la principal causa de pérdidas en el ámbito mundial, especialmente en animales jóvenes.¹ Se calcula que aproximadamente 25% de los becerros experimentan al menos un episodio de enfermedad respiratoria durante el primer año de vida, con tasas que van de 14 a 38%; estas incidencias son mayores en los becerros machos que en las hembras, tanto en la etapa previa al destete como en los periodos de engorda; además, se estima que las neumonías causan aproximadamente 75% de los casos clínicos, y provocan de 45% a 55% de la mortalidad; su tratamiento llega a representar 8% del total de los costos de producción.²

Los microorganismos del género Pasteurella constituyen las bacterias más frecuentemente aisladas de los procesos neumónicos de los animales domésticos; entre los cuales el problema de mayor significación es la pasteurelosis neumónica bovina (PNB), también llamada neumonía por fiebre de embarque; enfermedad respiratoria generalmente fatal que se caracteriza por una pleuroneumonía fibrinosa grave, y que afecta principalmente a animales menores de un año recientemente transportados, con una mayor incidencia en becerros de 1 a 5 meses de edad nacidos durante otoño e invierno.^3-6

La PNB es una de las enfermedades más costosas que afecta al ganado bovino productor de leche o productor de carne, especialmente en aquellos animales de reciente ingreso en el hato; se considera la enfermedad económicamente más importante en bovinos productores de carne y la segunda, después de las enfermedades grastrointestinales, en becerras lecheras,⁷ por lo que es una de las principales causas de pérdidas en la industria ganadera bovina del mundo; se calcula que representa 30% de la mortalidad total en bovinos, y al menos 1% en las ganaderías de engorda, y está relacionada con pérdidas económicas por más de mil millones de pesos anuales tan sólo en Norteamérica.^3,6,8-10 Además, es responsable de la morbilidad y pérdidas por ganancia de peso en al menos 10% adicional de estas ganaderías; consecuentemente, los costos por la enfermedad en la industria ganadera de Estados Unidos de América son de, al menos, 640 millones de dólares anuales.⁹ Esta enfermedad es una de las principales causas de morbilidad y mortalidad en becerras lecheras en ese país y Canadá, con brotes que llegan a afectar entre 80% y 90% de los animales, con tasas de letalidad menores a 5%.⁵

Considerando que Mannheimia haemolytica es el principal patógeno bacteriano de la PNB, para los propósitos de este artículo se nombrará a esta última como mannheimiosis bovina a lo largo de todo el texto.

Etiología

La etiología de la mannheimiosis bovina (MnB) es multifactorial y se ven involucrados diversos factores de riesgo que determinan la presentación y severidad de las lesiones neumónicas; entre ellos destacan los relacionados con el manejo que generan estrés, como cambios bruscos de temperatura, hacinamiento, transporte, confinamiento de animales de diferentes edades, condiciones del destete, nivel de inmunoglobulinas en el calostro, entre otros; asimismo, intervienen otros agentes infecciosos de origen bacteriano y particularmente agentes primarios de tipo viral, tales como el virus sincitial, parainfluenza,³ rinotraqueítis infecciosa bovina (herpes virus 1) y, ocasionalmente, adenovirus.^4,5,10,11 Estos virus causan efecto citopático directo en el aparato respiratorio; además, reducen la remoción bacteriana y la capacidad fagocítica del macrófago alveolar, lo cual facilita la colonización pulmonar por Pasteurella spp.¹¹

Las especies del género Pasteurella son comensales habituales del tracto respiratorio superior de los rumiantes domésticos y silvestres, y no obstante que Mannheimia (Pasteurella) haemolytica y P. multocida con mucha frecuencia se encuentran asociadas con enfermedades respiratorias, hay variaciones entre las diferentes cepas en su capacidad para producir enfermedad en los diferentes huéspedes animales.^9,12

P. multocida se ha identificado como un importante patógeno de los animales durante muchos años; sin embargo, la frecuencia y la significancia de Mannheimia (Pasteurella) haemolytica como un patógeno potencial ha sido reconocida ampliamente en los últimos años, y numerosas investigaciones sobre enfermedades virales han demostrado que P. multocida y Mannheimia (Pasteurella) haemolytica, actúan más frecuentemente como invasores secundarios que como causa primaria de enfermedad.¹³

Mannheimia (Pasteurella) haemolytica es la bacteria más patógena y más comúnmente asociada con el complejo de las enfermedades respiratorias de los bovinos, particularmente con la MnB.^6,8,10,14 La bacteria es un habitante normal de las criptas de las tonsilas del bovino sano y, además, un importante agente oportunista del tracto respiratorio debido a que usualmente coloniza la parte alta de éste y, bajo ciertas condiciones de inmunosupresión del huésped, afecta sus mecanismos de defensa, lo cual permite que la bacteria se establezca y se multiplique rápidamente, penetre a los pulmones durante la inhalación e inicie una infección activa del epitelio alveolar.¹⁰

Esta bacteria ha sido sometida a una extensa reclasificación; originalmente fue llamada Bacterium bipolare multocidum por Theodore Kitt, en 1885;^2,9 posteriormente, en 1896, Flugge la renombra Bacillus boviseptica⁹ y, en 1932, Newson y Cross proponen el nombre de Pasteurella haemolytica. ^2,9,15 Entre 1959 y 1961, Smith describe dos biotipos de P. haemolytica sobre la base de características fenotípicas y de diferencias epidemiológicas y patológicas, clasificándolos como A y T, según su habilidad para fermentar la L-arabinosa o la trealosa, respectivamente.^2,9,15-18

Biberstein et al.^15,19 desarrollaron en 1960, un sistema de serotipificación basado en la hemoaglutinación indirecta (HAI) de antígenos capsulares solubles, y, en 1962, Biberstein y Gills²⁰ informaron sobre una asociación consistente entre los serotipos y los biotipos que establece una serotipificación capsular.^15,16 En investigaciones subsecuentes, el número de serotipos reconocidos aumentó a 17^15,21 los serotipos 3, 4, 10 y 15 asociados con el biotipo T y el resto con el biotipo A; las cepas no tipificables por HAI fueron clasificadas posteriormente por contra-inmunoelectroforesis, demostrándose nueve serogrupos adicionales.¹⁵

En 1990, a partir de los resultados obtenidos en estudios sobre hibridación ADN-ADN, propiedades bioquímicas y análisis genéticos, los serotipos T3, T4, T10 y T15, del biotipo T, fueron reclasificados como una especie separada que se denominó Pasteurella trehalosi. ²² En 1995, Younan y Fodor²³ informaron sobre el aislamiento de P. haemolytica serotipo 17 (A17). Recientemente, P. trehalosi ha sido reclasificada como Bibersteinia trehalosi.²⁴

Mannheimia haemolytica

El género Pasteurella está conformado por un amplio grupo de especies de bacterias que se entrecruzan en sus características fenotípicas y genotípicas, por lo que desde hace varios años se han realizado investigaciones con el propósito de clasificarlas adecuadamente. Los primeros estudios sobre hibridación del ADNARN demostraron una homología de 8% a 24% entre aislamientos de P. haemolytica y P. trehalosi; posteriores investigaciones validaron dichos resultados con estudios de hibridación de ADN-ADN, los cuales mostraron una homología de 0%-35% entre P. haemolytica y P. trehalosi. ¹²

En 1999, mediante estudios de ribotipificación, electroforesis de enzimas multi-locus, secuenciación del gene 16S del ARNr e hibridación ADN-ADN, los serotipos de P. haemolytica A fueron reclasificados en el nuevo género Mannheimia. En consecuencia, los anteriores serotipos A de P. haemolytica (A1, A2, A5, A6, A7, A8, A9, A12, A13, A14, A16 y A17) fueron renombrados como Mannheimia haemolytica. El serotipo 11 restante, que no está relacionado con Mannheimia haemolytica, se renombró como Mg.^2,6,9,15

Según la clasificación propuesta por Angen et al.,¹⁵ el género Mannheimia comprende cinco especies: M. haemolytica (Mh) (originalmente biogrupo 1) que incluye los serotipos A (1, 2, 5-9, 12-14, 16 y 17), todos aislados solamente de rumiantes. M. granulomatis, que incluye a cepas previamente clasificadas como P. granulomatis, Bisgaard taxón 20 y P. haemolytica biogrupo 3J. Incluye también todas las cepas clasificadas genéticamente como P. haemolytica-like (parecidas a P. haemolytica), aisladas de conejos, liebres y bovinos, asociadas con neumonías y conjuntivitis purulenta en lepóridos y con granulomas en piel y otras enfermedades en bovinos. M. glucosida incluye cepas originalmente clasificadas como P. haemolytica biogrupos 3 A-H y 9, así como al serotipo 11 y todas sus cepas, la mayoría aisladas de cavidad nasal de borregos, en algunos casos con neumonías u otras enfermedades. M. ruminalis, que incluye cepas no hemolíticas de P. haemolytica previamente descritas como Actinobacillus lignieresii y P. haemolytica biogrupo 3J, aisladas del rumen de bovinos y ovinos, no asociadas con estados patológicos. Por último, M. varigena, que comprende un grupo de cepas originalmente clasificadas como P. haemolytica biogrupo 6 y Bisgaard taxón 15 y 36, han sido aisladas de bovinos y porcinos, y asociadas con sepsis, neumonía y otros estados patológicos.^2,9,15,25

Mh es una bacteria gramnegativa, encapsulada, no móvil, de forma cocobacilar o de bacilo pequeño pleomórfico (1 a 3 µm de diámetro), mesofílica, aerobia y anaerobia facultativa, oxidasa positiva e indol-negativa; fermenta glucosa y otros carbohidratos, produciendo ácido pero no gas. Es negativa a las pruebas de rojo de metilo, gelatinasa, Voges-Proskauer. Crece en agar MacConkey, en medios enriquecidos como agar chocolate o agar sangre, formando colonias lisas de color blanco grisáceo, con tamaños de 1 a 2 mm de diámetro después de 24 h de incubación. La mayoría de las cepas producen una β-hemólisis cuando crecen en agar con sangre de bovino. Es capaz de fermentar D-sorbitol, D-xilosa, maltosa y dextrina; no fermentan arabinosa o glucósidos, y son negativas a la ornitina descarboxilasa y NPG (β-glucosidasa), pero positivas a ONPF (α-fucosidasa). La presencia de cápsula con propiedades de superficie antifagocíticas la hacen parcialmente resistente a fagocitosis.^15,18

Mh se aísla normalmente de procesos neumónicos en bovinos y ovinos, y también de procesos septicémicos en borregos y de mastitis en ovejas. Algunos de los serotipos probablemente forman parte de la microflora residente del tracto respiratorio superior de los rumiantes, aunque con frecuencia es difícil su aislamiento.^4,15,18 En bovinos que desarrollan pasteurelosis neumónica, probablemente haya portadores sanos de la cepa de Mh que causa la neumonía, o es posible que sean cepas adquiridas de otros animales.⁴

Mh es el principal agente etiológico en el complejo de las enfermedades respiratorias de los bovinos, particularmente de la MnB.^5,11,25 Constituye un nuevo miembro de la familia Pasteurellaceae que originalmente incluía los géneros Haemophilus, Actinobacillus y Pasteurella (HAP). La mayoría de los miembros de la familia HAP son comensales de la mucosa de mamíferos, incluyendo humanos, pájaros y reptiles, no obstante, muchos son patógenos oportunistas y pueden producir enfermedad bajo condiciones apropiadas.^6,18

De los 12 serotipos reconocidos de Mh, A1 y A2 son los más prevalentes en el mundo. Estos dos serotipos son los que con mayor frecuencia se aíslan de becerros;²⁶ el A1 es el que se aísla más frecuentemente de lesiones neumónicas en los casos de MnB, aun cuando en bovinos sanos son más frecuentes los serotipos A1 y A2 en la nasofaringe,²⁷ en ocasiones también se aíslan los serotipos A2, A5, A6, A7 y A9.^{2,5,6,8-10,28,29} En estudios recientes en Alemania y Estados Unidos de América, además del A1, el A6 ha sido registrado como el más frecuentemente aislado en pulmones neumónicos de bovinos.^30,31 También se han registrado los serotipos A11 (Mg) y A12.^2,32,33 No obstante que en los bovinos, por lo general, sólo se encuentran los serotipos A1 y A2, este último se asocia con la pasteurelosis neumónica más frecuentemente en ovinos que en bovinos.^8,28,34 Estos dos serotipos son capaces de colonizar el tracto respiratorio superior de bovinos y ovinos y con frecuencia son especie-específicos en su capacidad de afectar el tracto respiratorio inferior y producir enfermedad.^2,9

En los bovinos sanos es común que el serotipo A2 esté presente en el tracto respiratorio superior, pero después de un estado de estrés o de una infección viral, el serotipo A1 rápidamente reemplaza al A2 como el serotipo principal; esto probablemente se deba a una transmisión horizontal a partir de animales enfermos que tengan el A1 activo en secreciones nasales.^2,9 Se ha podido comprobar que el serotipo A2 predominaba en exudado de becerros en granja, y cuando estos animales fueron trasladados a corrales de subasta y luego a corrales de engorda se encontró que predominaba el A1. En los ovinos es posible aislar cualquiera de los serotipos.^16,28 Diversos estudios serológicos sugieren que es posible que ocurra la transmisión interespecie de Mh desde animales domésticos hacia animales silvestres o de vida libre, o viceversa.³⁵

Cepas de Mh no tipificables (NT) también se aíslan con frecuencias variables, a veces altas,¹⁷ que varían dependiendo de la fuente de aislamiento. En Gran Bretaña se ha registrado 9.3% en exudado nasal y 12.8% en pulmones neumónicos de becerros,²⁶ y en vacas, 20.1% en exudado nasal, 16.2% en pulmones neumónicos, 29.4% en sangre, 25% en hígado y bazo, 72.2% en tracto genital, 89.5% en ubre y leche, 66.7% en tracto intestinal y 16.6% en cerebro.³⁶ En exudado nasal de ovinos se ha registrado 9.3% en México,³⁷ 15.8% en Estados Unidos de América³⁸ y 25% en Dinamarca,³⁹ y en pulmones neumónicos, 3.6% en Etiopía,⁴⁰ 7% en Hungría²¹ y 8.3% en Turquía.⁴¹

En estudios recientes realizados en México se encontraron frecuencias superiores a las registradas hasta ahora en otros países. En exudado nasal de bovinos se encontraron frecuencias de 69% en animales sanos y 67% en animales enfermos,^32,33 y en pulmones neumónicos de bovinos, 71%.⁴²

Esta cepas NT normalmente corresponden al biotipo A⁴³ y se han descrito como mutantes de Mh, algunas de las cuales presentan deficiencias en la producción de antígenos solubles.⁴⁴ En este sentido, algunos estudios citados por Frank⁴³ mencionan la posibilidad de que cepas clasificadas como NT por la técnica de hemoaglutinación indirecta (HAI), quizá sean cepas serotipificables mediante dicha técnica, pero que la imposibilidad de reaccionar a la HAI puede ser consecuencia de la pérdida de antígenos serotipo-específicos en la superficie celular, lo que corrobora las dificultades que se presentan para la serotipificación de Mh mediante la HAI.

Mecanismos de patogenicidad

Los mecanismos de patogenicidad de algunos de los miembros de la familia Pasteurellaceae no están aún muy claramente definidos, particularmente la patogé- nesis de la PNB, ya que algunos de los mecanismos que le permiten a Mh establecerse y diseminarse durante la infección, no están esclarecidos satisfactoriamente, incluso existe la posibilidad de que haya diferencias en dichos mecanismos entre las cepas aisladas de diversos cuadros neumónicos, así como de cepas procedentes de animales sanos.^6,9,45

En las cepas de Mh que afectan a los rumiantes se han identificado diversos mecanismos de expresión de su patogenicidad a través de potentes antígenos, los cuales incluyen: una leucotoxina (Lkt) con actividad específica contra leucocitos; lipopolisacáridos (LPS), proteínas de membrana externa (PME), proteínas reguladas por hierro (PRH), fimbrias, enzimas (neuraminidasa, proteasas, metaloglicoproteasas), antígenos aglutinantes serotipo-específico y adhesinas; además de la cápsula y plásmidos de resistencia a antibióticos.^6,8,14,46-48 Todos estos mecanismos juegan un papel fundamental en la patogénesis de la enfermedad; sin embargo, sólo la Lkt es considerada como el factor de patogenicidad primario más importante.^10,14,45,46 Todos los genes relacionados con los factores de virulencia identificados han sido localizados en el genoma de Mh A1, el cual ha sido secuenciado recientemente.⁴⁹

Leucotoxinas (Lkt)

Las Lkt son un grupo de exotoxinas que producen su efecto tóxico primario en contra de los leucocitos, en particular los leucocitos de rumiantes, especialmente las células polimorfonucleares (PMN).^10,48,50,51 La toxina origina una amplia variedad de efectos bioló- gicos sobre los leucocitos bovinos, cuyo resultado final es una pleuroneumonía fibrinosa aguda.^10,50

En estudios realizados en 1980¹⁸ se pudo comprobar que el sobrenadante libre de células de cultivos de Mh A1 podía producir fagocitosis a bajas concentraciones y era citotóxico a altas concentraciones; posteriormente se pudo descubrir que el sobrenadante contenía una leucotoxina (Lkt) termolábil secretada por Mh durante su crecimiento exponencial.^9,18

La Lkt A de Mh forma parte de la familia de exotoxinas producidas por bacterias gramnegativas, llamadas toxinas RTX, en razón de que contienen un número variable de dominios de aminoácidos repetidos ricos en glicina, de los cuales la familia de toxinas RTX (repeats-in-toxin) deriva su nombre y causan una amplia variedad de efectos característicos sobre las células en que actúan.^{9,45,47,52,53} Las toxinas RTX se han encontrado en los 12 serotipos del género Mannheimia.¹⁸

La Lkt de Mh es una proteína termolábil, calciodependiente, estable al oxígeno y al pH, y soluble en agua, y las más altas concentraciones en su producción se dan en la fase logarítmica del crecimiento de la bacteria.^54,55 Se ha podido comprobar que el hierro es un factor requerido para el óptimo crecimiento de la bacteria y para la producción de la Lkt.⁵⁶

Los genes de la Lkt de Mh han sido secuenciados y la toxina se ha expresado en E. coli. La organización genética del operón de la Lkt de Mh (lktCABD) es similar a la del operón de la hemolisina de E. coli (hlyCABD), y contiene cuatro genes. El primer gen es el lktC, el cual codifica una proteína (LktC) que es la responsable de la activación de la leucotoxina (Lkt) por acilación. El segundo gen es el lktA, el cual codifica la estructura proteínica de la leucotoxina (LktA). Finalmente, los genes lktB y lktD codifican para las proteí- nas LktB y LktD, que en conjunto son responsables de la transportación y la secreción de la leucotoxina (LktA).^10,14,45,52 La Lkt de Mh tiene una estrecha especificidad contra células blanco y es citotóxica contra los leucocitos de rumiantes,18 y se ha identificado a la molécula CD18 como el receptor que interviene en la adherencia de la Lkt con los leucocitos de rumiantes.^10,18,52,57

La actividad de la LktA contra las células blanco es dosis dependiente y se puede clasificar en tres categorías. A muy bajas concentraciones la leucotoxina activa las células blanco para experimentar una interrupción de la respiración y la degranulación. A medida que la concentración de leucotoxina se incrementa, las células blanco son estimuladas para que experimenten apoptosis (muerte celular programada); cuando la concentración de la leucotoxina es alta se presenta una necrosis de las células blanco como consecuencia del daño a la membrana debido a la formación de poros. De esta manera, aumenta la posibilidad de colonización de la mucosa respiratoria por parte de la bacteria.^9,10

El efecto mejor conocido de las toxinas RTX sobre los neutrófilos es la formación de poros (0.9 a 3 nm de diámetro) que atraviesan la membrana.¹⁸ En altas concentraciones, la Lkt causa una rápida (5-15 min) pérdida del potasio intracelular y el hinchamiento de la célula. La formación de numerosos desperfectos de la membrana plasmática depende del calcio; entre ellos se incluyen poros hasta de 10 nm de diámetro sobre la superficie de la célula, estos poros hacen que la membrana celular sea permeable a los iones y a la salida de agua, lo que origina la lisis celular.^9,45,47

Por lo tanto, en la MnB los macrófagos alveolares desempeñan un papel central en todos los procesos celulares y en la cascada inflamatoria que conduce al daño pulmonar.¹⁰ Entre los leucocitos, los macrófagos son más resistentes que los neutrófilos contra el efecto lítico de las Lkt, y entre los macrófagos alveolares son más resistentes los de los bovinos adultos que los de becerros menores de 16 semanas de edad.²

La inducción de la secreción y la liberación de péptidos quimiotácticos vasoactivos por células maestras, aumenta el número de leucocitos disponibles en el lugar de la inflamación, en donde se producen depó- sitos fibrinosos, este proceso culmina en una neumonía fibrinopurulenta aguda. Cualquier oportunidad de respuesta inmune secundaria es interrumpida por la actividad de la Lkt, que previene la blastogénesis de los linfocitos.¹⁰

La interacción de la Lkt con el sistema inmune del huésped es compleja e inteligente; induce efectos biológicos en los leucocitos bovinos de una manera especie-específica,^47,58,59 pone al sistema del huésped a trabajar en beneficio de la bacteria y deja a los tejidos de dicho portador desvalido en contra de la infección.¹⁰

Proteínas de membrana externa (PME)

Se han realizado estudios enfocados a la identificación de proteínas de la superficie celular y PME producidas por diversos serotipos de Mh como potenciales inmunógenos para prevenir la pasteurelosis neumónica en el ganado.^29,60

Los resultados de diversos estudios resaltan que las PME de Mh constituyen algunos de los más importantes antígenos para la estimulación de respuesta inmune en contra de la MnB,^29,61 y se ha podido comprobar una correlación estadísticamente significativa entre la resistencia a la enfermedad y la presencia de anticuerpos séricos dirigidos contra una gran cantidad de proteínas presentes en extractos salinos de la célula bacteriana íntegra.^61-63

Se sabe entonces, que las PME tienen un gran potencial para desarrollar inmunógenos, especialmente aquellas que están expuestas en la superficie.^9,63,64 Las proteínas expuestas en la cápsula de la célula bacteriana son un objetivo de gran interés para la respuesta inmune del huésped. Dos mecanismos muy importantes en la inmunidad de los bovinos en contra de Mh: la muerte mediada por el complemento y la fagocitosis mediada por los neutrófilos, son mejorados por la opzonización de la bacteria y por la eliminación de la cápsula.⁶¹

Se considera que los anticuerpos para las PME de las bacterias gramnegativas también suministran protección contra la infección por Mh. Es probable que estos anticuerpos promuevan la fagocitosis y quizá también la muerte, al disminuir la función de estas proteínas.⁶⁰

Si bien el papel de las PME como factor de virulencia no está del todo dilucidado, diversos estudios han confirmado su importancia en la patogénesis de las infecciones y resaltan su participación potencial en la respuesta de anticuerpos en la protección antibacteriana, además de que participan como transportadoras de materiales a través de la membrana (porinas) y en la adhesión a la célula huésped.^60,65

De igual manera, se ha podido comprobar que las PME aisladas de Mh son poderosas moduladoras de la actividad de los leucocitos polimorfonucleados de bovinos e inducen alteraciones en su actividad bioló- gica, de tal manera que es posible observar in vitro, una reducción dosisdependiente en la capacidad de adherencia a la pared de nailon. Se cree que es posible que pequeñas cantidades de PME estimulen la quimiotaxis y la adherencia de los neutrófilos, favoreciendo de esta manera su acumulación en el foco inflamatorio inicial.⁶⁵

En ratones inmunizados con PME de Mh A1 y desafiados con Mh A1 viva, o con PME, se desarrolló neumonía broncointersticial muy similar a la MnB, además, se presentó una alta concentración de títulos de anticuerpos contra las PME, lo cual sugiere que el complejo inmune juega un papel muy importante en la patogénesis de la MnB.⁶⁶

El metaanálisis de 27 estudios realizados a lo largo de 12 años con vacunas experimentales y comerciales, reveló que aquellas que aportaron PME y otros antígenos de superficie, suministraron los mejores niveles de protección contra desafíos con Mh, equivalente al proporcionado por vacunas vivas.⁶⁷

La capacidad inmunogénica varía entre los diferentes serotipos de Mh, esto se ha podido comprobar con desafíos intratraqueales de ovejas con Mh A2, A7 y A9, inmunizadas con extractos de PME de los mismos serotipos. Aunque se encontraron altos niveles de anticuerpos, sólo la vacuna con PME de S7 produjo protección efectiva contra infección homóloga y heteróloga por Mh A2, A7 y A9.⁶⁸

Se ha comprobado que la presencia de anticuerpos contra PME de Mh tiene una correlación estadística con la resistencia a desafíos experimentales con dicho microorganismo en vacas. Se pudo clonar y secuenciar el gene que codifica una de dichas proteínas (PlpE), la cual es una lipoproteína similar a una lipoproteína de Actinobacillus pleuropneumoniae.⁶⁹ Estudios posteriores han podido demostrar que esta proteína recombinante (rPlpE) es altamente imnunogénica cuando se inyecta por vía subcutánea en bovinos y la inmunidad adquirida aumenta considerablemente en desafíos experimentales.^70,71

Sialoglicoproteasa (Gcp)

Entre los antígenos presentes en el sobrenadante de cultivos de Mh A1 destaca una O-sialoglicoproteína (Gcp) que es una metaloproteasa neutra, con actividad de endopeptidasa y neuroaminidasa, que tiene la capacidad de fraccionar glicoproteína A tipo mucina en diferentes sitios.^72-77

La presencia de anticuerpos (IgG1 e IgG2) contra la Gcp se pudo comprobar mediante el uso de sobrenadante de un cultivo de Mh A1 en fase de crecimiento logarítmico, que contenía una enzima proteolítica específica para Gcp y con el cual se vacunaron y se desafiaron grupos de becerros; en muchos de estos sueros se pudo comprobar que contenían IgG1 e IgG2; además, aquellos animales que tuvieron anticuerpos anti-Gcp, presentaron una neumonía más leve a la necropsia; estos resultados demostraron que la Gcp es inmunogénica y que la bacteria produce la enzima in vivo. ⁷⁵ El suero de bovinos convalecientes presenta actividad de Gcp, lo cual sugiere que esta Gcp es inmunogénica en los animales.¹⁸

Las células blanco de la Gcp aún no han sido bien definidas, pero probablemente son sialoglicoproteínas presentes en la superficie de las células de la superficie de la mucosa, macrófagos alveolares, neutrófilos alveolares u otros leucocitos.¹⁸ No obstante que el papel de la Gcp en la patogénesis no ha sido demostrado convenientemente, se ha sugerido que su actividad interfiere con la adhesión de los neutrófilos por una escisión de la O-sialoglicloproteína de las moléculas de adhesión celular; alternativamente, la Gcp puede interferir con la respuesta inmune del huésped por una escisión de las moléculas de la IgG séricas o quizá contribuya en la colonización bacteriana.^18,78 El gen de Gcp ya fue clonado en E. coli y secuenciado, desafortunadamente la Gcp se encontró agregada e inactiva en el periplasma de E. coli. ⁷² En becerros que habían sido desafiados con Mh A1 se logró inducir una protección significativa con la administración solamente de la Gcp como vacuna.⁷⁹

Neuraminidasa

La neuraminidasa es producida por Mh in vivo, ya que anticuerpos antineuraminidasa se pueden encontrar en el suero de cabras después de una infección transtoráxica con bacterias.⁸⁰ No obstante que el papel de la neuraminidasa en la neumonía bovina es desconocido, esta enzima ha sido implicada como factor de virulencia en diversos patógenos de mucosas.¹⁸ La producción de neuraminidasa por especies de Pasteurella se registró por primera vez en 1970, demostrando que 102 de 104 cepas de P. multocida y tres de cinco cepas de P. haemolytica habían producido la enzima.^80,81 Straus et al.⁸¹ pudieron demostrar que todos los serotipos de Mh, excepto el serotipo A11 (Mg), son capaces de producir neuraminidasa.

Se ha demostrado que la actividad protectora de la secreción salivar se reduce cuando se remueven los residuos de ácido siálico de las glicoproteínas salivares; es posible que la neuraminidasa ejerza un efecto patogénico mediante la remoción de los residuos de ácido siálico de las glicoproteínas del huésped, y de esta manera reduce el efecto protector del moco, incrementando la adherencia de Mh al epitelio de la mucosa, particularmente en el tracto respiratorio superior.^9,82,83 También se ha podido demostrar que aislamientos de Mh A1 pudieron producir niveles más altos de neuraminidasa que cepas del serotipo A2, lo cual puede evidenciar que la neuraminidasa está involucrada en la invasión de Mh en los procesos neumó- nicos.^84,85

Lipopolisacáridos (LPS)

El LPS de Mh es estructuralmente similar al de una bacteria típica gramnegativa. Este LPS tiene las actividades propias de las endotoxinas gramnegativas: pirogénicas, activación de macrófagos, inducción del factor de tumoración, activación de la coagulación en cascada, agregación de plaquetas e inducción del choque endotóxico.^2,86

La administración intrabronquial de LPS purificado de Mh originó la exudación de fibrina y neutrófilos, edema pulmonar y agregación de plaquetas en los capilares, implicando al LPS como la principal causa de necrosis microvascular y trombosis.^18,86,87 El LPS de Mh A1 fue capaz de causar daño directo sobre las células del endotelio de las arterias pulmonares in vitro; demostrando la función potencial de las endotoxinas en la patogénesis de la lesión vascular en la MnB.⁸⁶

La participación del LPS podría ser el resultado de las funciones moduladas por los leucocitos bovinos y la simulación de la respuesta inflamatoria del huésped, de este modo se exacerba el daño a sus tejidos; de igual manera, el LPS participa como mediador en el incremento de las citocinas proinflamatorias, lípidos mediadores, procoagulantes, radicales de oxí- geno y proteasas, generados por los monocitos y los macrófagos bovinos.^2,18 Se ha podido demostrar que el LPS incrementa la actividad citolítica de la Lkt y que aumenta la expresión Lkt-dependiente de la IL8 y el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α).^88,89 Es probable que in vivo, el LPS y la Lkt actúen de manera sinérgica causando daño a los tejidos e inflamación.⁹

Adhesinas

Se sabe de manera general que las bacterias se pueden adherir a las superficies epiteliales a través de receptores específicos, de tal manera que los factores bacterianos involucrados en la interacción bacteria-célula son muy diversos; entre algunas de las estructuras bacterianas que pudieran participar en la adherencia se reconocen las fimbrias, adhesinas no fimbriales, adhesinas proteináceas, el glicocálix, el LPS, proteínas de membrana externa y la cápsula.⁸³Poco se sabe acerca de las moléculas que participan en la habilidad de Mh para colonizar la faringe y las criptas tonsilares; es probable que codifique una adhesina que permita a la bacteria atacar el epitelio respiratorio,⁹ también se ha mencionado la participación del LPS, las fimbrias y el glicocálix;⁸³ se ha podido demostrar la capacidad del LPS de Mh para producir adherencia in vitro,⁸⁷ también se conoce que el componente del polisacá- rido capsular facilita que Mh pueda unirse específicamente a los fagocitos e impedir el desarrollo de sus funciones.⁸³ Se sabe que existen dos tipos de fimbrias en Mh, unas largas y rígidas de 12 nm, y otras cortas y flexibles de 5 nm, las cuales pudieron ser evidenciadas especialmente cuando las bacterias fueron recuperadas de lavados traqueales de becerros infectados experimental o naturalmente.⁵¹

El papel funcional de las adhesinas de Mh en la patogénesis debe ser estudiado con más detalle, no obstante es muy posible que esta adhesina participe en un proceso secuencial de reconocimiento de la célula huésped, que precede a la liberación de exoproteínas con actividad catalítica, como la endopeptidasa o neuraminidasa, o ambas. Se considera que las adhesinas de Mh constituyen una alternativa como un inmunógeno potencial para el desarrollo de vacunas en contra de la MnB.⁷⁷

En estudios recientes en México, Jaramillo et al. ⁷⁷ lograron la purificación por afinidad de una adhesina de 68 kDa que fue capaz de aglutinar específicamente eritrocitos de conejo, concluyendo que las adhesinas de Mh juegan un importantísimo papel en la infección. La adhesina de Mh es similar a una adhesina de alto peso molecular caraterizada en cepas no tipificables de H. influenzae. ¹⁸

Plásmidos

En Mh se ha podido demostrar la existencia de plásmidos de resistencia a antibióticos; aun cuando la presencia de plásmidos no es un fenómeno característico entre todas las especies, algunas cepas poseen sólo un plásmido pequeño (aproximadamente 4.2 kb), el cual es responsable de la resistencia contra estreptomicina y sulfonamidas.^9,18,51 En estudios con cepas de Mh A1, en la mayoría de ellas se pudo aislar un plásmido que codificaba una β-lactamasa, sólo unas pocas presentaron dos o ningún plásmido.⁴ No todos los plásmidos encontrados están asociados con resistencia a antibió- ticos, paradójicamente fue posible encontrar resistencia en ausencia de plásmidos y algunos de ellos fueron correlacionados con la leucotoxina u otros factores de virulencia.^9,51

Los plásmidos juegan un papel muy importante en la estructura genética de resistencia antimicrobiana de Mh. Entre los genes de resistencia a antimicrobianos uno de los más frecuentes en Mh es el de resistencia a sulfonamidas (sulII). La mayoría de estos genes se han encontrado en plásmidos de 4.2 a 16.7 kb, algunos de los cuales también generan resistencia contra estreptomicina, kanamicina y tetraciclinas; asimismo, la resistencia a β-lactámicos está asociada con pequeños plásmidos de 4.2 a 5.2 kb; también se ha identificado un pequeño plásmido de menos de 10 kb, asociado con resistencia a aminoglicósidos, así como uno de aproximadamente 113 kb de resistencia con estreptomicina, kanamicina, tetraciclinas y sulfonamidas; de igual manera, el gen de resistencia a estreptomicina (strA) se ha encontrado tanto en plásmidos como en el cromosoma de Mh; la resistencia a cloranfenicol está mediada principalmente por las cloramfenicol-acetiltransferasas, muchas de las cuales están localizadas en plásmidos que han sido identificados en Mh.⁹⁰

Diagnóstico

Para la detección e identificación de Mh se cuenta con diversas técnicas de laboratorio que incluyen: aislamiento y fenotipificación, serotipificación y genotipificación.

Para el aislamiento y fenotipificación se utiliza el cultivo in vitro en medios a base de agar sangre, además de pruebas bioquímicas, todo lo cual permite determinar la morfología de las colonias, la producción de hemólisis, así como su comportamiento bioquímico para efectos de su identificación y biotipificación.^15,16 Además de los métodos convencionales disponibles para la identificación bioquímica de Mh, se dispone de otros métodos alternativos, que se basan en sistemas miniaturizados disponibles comercialmente y que facilitan y agilizan la fenotipificación; entre ellos se encuentra el sistema API 20E y 20NE,* tabletas diagnósticas** y el sistema OxiFerm,*** que se han usado ampliamente como una herramienta en la identificación de enterobacterias y no enterobacterias en medicina veterinaria, con resultados muy satisfactorios.^{7,35,39,91-94}

Para la serotipificación se emplean técnicas de hemoaglutinación mediante la utilización de antisueros de referencia específicos para los 12 serotipos reconocidos. Otra prueba serológica que se puede utilizar es la técnica de ensayo visual simple a partir de la obtención de LktA de aislamientos de Mh, para determinar la presencia de anticuerpos anti-LktA en el suero de los animales problema; de igual manera, mediante la técnica de inmunoelectrotransferencia, a partir de proteínas obtenidas de la membrana externa de Mh, que se emplean como antígenos para determinar el patrón de reconocimiento por anticuerpos contra dichos antígenos.¹⁶

La variabilidad y complejidad de las características fenotípicas y genotípicas del género Mannheimia dificultan en gran medida la clasificación de los aislamientos a través de las técnicas de laboratorio rutinarias, basadas en criterios descriptivos convencionales, que hacen imposible la clasificación taxonómica precisa. Las técnicas clásicas para la identificación de bacterias, tales como la biotipificación, serotipificación, determinación de patrones de susceptibilidad a antibióticos y fagotipificación, se basan en diferencias fenotípicas, no obstante estas técnicas se ven limitadas por la capacidad de las bacterias de alterar, de manera impredecible, la expresión de algunas de sus características, de tal manera que aislamientos de una misma cepa pueden variar fenotípicamente; adicionalmente, algunos de estos métodos se ven limitados por la relativa gran cantidad de cepas que son fenotípicamente nulas, es decir, no tipificables.^95,96

Los métodos fenotípicos para la caracterización de las especies de Mannheimia se han utilizado durante mucho tiempo y aunque se acepta que su reproducibilidad es alta, sus limitaciones ya han sido reconocidas ampliamente.^39,97 En estudios realizados para evaluar la especificidad de la serotipificación como una herramienta diagnóstica, se ha demostrado que no es un método confiable para la correcta identificación de Mh, y se hace énfasis sobre la necesidad de una amplia caracterización fenotípica y genotípica para la adecuada tipificación de este microorganismo, considerando las dificultades que han presentado otros estudios para su clasificación, basada solamente en la fenotipificación y la serotipificación,^25,39,98 teniendo en cuenta que el género Mannheimia abarca taxones de una gran heterogeneidad fenotípica y genotípica.³⁹

Es evidente que los estudios sobre caracterización epidemiológica requieren del uso tanto de los métodos fenotípicos como genotípicos. Diversas técnicas de biología molecular han demostrado su utilidad en el estudio de la taxonomía, patogénesis y epidemiología de Mh. Entre las técnicas empleadas en diversas investigaciones sobre la epidemiología molecular de aislamientos de Mh se pueden destacar las siguientes: análisis de restricción para la detección de los genes del ARNr o ribotipificación, polimorfismo de la longitud de los fragmentos de restricción (RFLP), análisis de endonucleasas de restricción (REA) del ADN cromosomal, hibridación de ADN-ADN, electroforesis de enzimas multilocus (EEML), amplificación al azar del polimorfismo del ADN (RAPD), secuenciación del ADN, electroforesis en gel de campos pulsados (PFGE) y análisis del polimorfismo de la longitud de fragmentos amplificados (AFLP).^15,39,97-99 Todos estos métodos tienen como base el estudio del polimorfismo del ADN bacteriano y se ha demostrado su alto poder de discriminación para la diferenciación de cepas, superior a los métodos convencionales de tipificación fenotípica.^15,95,96,100

Prevención y control

Dada la complejidad que involucra la multicausalidad de esta enfermedad, las medidas de prevención y control siguen siendo motivo de análisis y polémica respecto de su eficacia y la eficiencia de la inmunización, el empleo de quimioterapéuticos y el control de factores medioambientales que propician el estrés en los animales y favorecen la acción invasora de Mh a través de sus complejos mecanismos de virulencia.

Tradicionalmente, el tratamiento contra la MnB se ha basado en el uso intensivo de antibióticos, incluyendo, además, el tratamiento masivo de hatos, lo cual ha determinado un incremento en la incidencia de cepas multirresistentes de Mh. De ahí que sea preferible una prevención y control de la enfermedad, basada más en la vacunación que en la quimioterapia.⁹ La selección de los antimicrobianos a emplear, raramente se basa en estudios previos de sensibilidad in vitro de cepas aisladas a partir de exudado nasal o traqueal, considerando, además, que estos aislamientos no reflejan necesariamente los microorganismos presentes en el tejido pulmonar.¹⁰¹

Para el tratamiento de la MnB se ha empleado una gran variedad de antimicrobianos que incluyen principalmente penicilinas, oxitetraciclina, trimetoprim/ sulfadoxina, ampicilina, tilmicosín, florfenicol y tulatromicina, y aunque todos ellos han demostrado eficacia, también se ha podido comprobar la resistencia contra peniclina, ampicilina, tetraciclina, sulfonamidas y tilmicosín en muchos aislamientos de Mh.¹⁰² Una revisión más amplia sobre dosificación y eficacia de diversos antimicrobianos en el tratamiento de la MnB, así como sobre resistencia a antimicrobianos de Mh, se encuentra en Rice et al. ¹⁰² y Highlander.⁹

Existe en el mercado una amplia gama de vacunas, desafortunadamente no hay mucha información publicada en revistas arbitradas que sustenten su eficacia en estudios con desafíos controlados o en condiciones de campo.^9,103

Aparentemente, estas vacunas sólo aportan una protección parcial, incluso algunas, como las preparadas a base de células íntegras, pueden llegar a incrementar la morbilidad en el hato.¹⁰⁴ Otra estrategia de prevención en lotes de engorda ha sido el empleo de vacunas únicamente contra agentes virales, la cual también ha resultado poco efectiva.¹⁰³

El desarrollo de vacunas efectivas contra la MnB depende primordialmente del conocimiento detallado de los antígenos y factores de virulencia de Mh, necesarios para estimular una protección inmune. Estos antígenos incluyen componentes de la superficie bacteriana (LPS, OMP) además de moléculas secretadas (Lkt).⁹

Se ha podido demostrar correlación entre los títulos de anticuerpos antileucotoxina neutralizantes y la resistencia a la enfermedad; sin embargo, el empleo de la Lkt sola, purificada o recombinante, no ha sido suficiente para originar protección.^62,78 De manera similar, el empleo de polisacáridos capsulares combinados con Lkt tampoco ha generado protección; sin embargo, el sobrenadante de cultivos mezclados con Lkt recombinante ha sido efectivo en ensayos con animales desafiados, lo que sugiere que la mejor opción como vacuna para la MnB sea la mezcla de Lkt asociada con antígenos de sobrenadante.⁹

También se ha informado sobre algunos resultados exitosos mediante el uso de vacunas vivas; sin embargo, existe la preocupación respecto a la posible virulencia de estas cepas.^105,106

Estudios recientes se han enfocado a lograr la inducción de inmunidad local contra Mh, mediante la liberación de antígenos a través de la mucosa, reduciendo así la colonización de la nasofaringe por parte del microorganismo,¹⁰² ya sea mediante la expresión de antígenos de Mh en vectores virales, que facilitarían la replicación en el tracto respiratorio superior, o la administración oral de dichos antígenos encapsulados en microesferas de alginato,^102,107 así como el desarrollo mediante ingeniería genética, de plantas para la expresión de antígenos de Mh, a fin de producir vacunas transgénicas comestibles.¹⁰⁸ Estos antígenos derivados de plantas fueron inmunogénicos cuando se inyectaron en conejos y también mediante vacunas orales estimularon una respuesta inmune en la mucosa de becerros.¹⁰⁹

Conclusiones

El impacto de la MnB en la industria bovina, tanto en ganado productor de carne como de leche, ha sido ampliamente comprobado en diversos estudios, tanto en Norteamérica como en Europa;^1,2 desafortunadamente poco se sabe al respecto en los países de América Latina y en México en particular. Esta enfermedad se considera como la más importante en bovinos productores de carne y la segunda, después de las gastrointestinales, en becerras lecheras.⁷

La MnB se desencadena como consecuencia de un desbalance en la interacción en la tríada constituida por uno o más agentes infecciosos, las defensas del huésped y factores estresantes medioambientales; no obstante esta complejidad etiológica, la mayoría de los estudios coinciden en que el microorganismo involucrado como el principal agente etiológico es la Mh A1.^2,6,8-10

Los mecanismos de patogenicidad de esta bacteria no están del todo esclarecidos, y es posible que existan diferencias entre cepas aisladas de diferentes cuadros neumónicos o de animales sanos.^6,9,45 Son varios los mecanismos de patogenicidad identificados en Mh, los cuales han sido motivo de análisis y discusión en diversos estudios.^6,8,14,46,47Entre ellos destaca particularmente la Lkt como el factor más importante y más ampliamente estudiado, y no obstante la capacidad inmunogénica comprobada en algunos de dichos mecanismos, se considera que la Lkt juega el papel más preponderante en la inducción de una respuesta protectora.^9,18

Siguen existiendo enigmas respecto de Mh, particularmente relacionados con aspectos de patogenicidad, virulencia y taxonomía, debido a la variabilidad y la complejidad de las características fenotípicas y genotípicas del género Mannheimia, así como por las dificultades en su manipulación genética.⁹ Para una comprensión más amplia de la epidemiología y la importancia de todas las especies de Mh, es necesario adoptar nuevos criterios para su identificación, que incluyan la utilización de técnicas moleculares, así como procedimientos más sensibles de aislamiento e identificación bioquímica e inmunológica.

Los métodos fenotípicos para su clasificación, no obstante su alta reproducibilidad, presentan limitaciones. La serotipificación en particular, no es confiable por sí sola, si no es apoyada por una sólida caracterización bioquímica. Por esta razón, la adecuada tipificación de este microorganismo requiere de una amplia caracterización fenotípica y genotípica.^25,44,97,98

Las investigaciones basadas en ensayos experimentales de desafío o en el estudio acerca de la epidemiología, taxonomía y virulencia, aportarán información primordial sobre el comportamiento de Mannheimia haemolytica en bovinos y otras especies animales.

Las medidas de prevención y control más eficaces contra la MnB se deben sustentar en la combinación de un conjunto de actividades que incluyan un diagnóstico confiable, vacunas y medidas terapéuticas eficaces, y buenas prácticas de manejo.

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Mannheimiosis bovina: etiología, prevención y control

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