Identificación de Campylobacter fetus por cultivo y real time PCR en muestras prepuciales de toros

La campylobacteriosis genital bovina (CGB) es una enfermedad que causa infertilidad en rodeos de cría de nuestro país (Repiso y col. 2005). El cultivo microbiológico se considera la técnica de referencia para el diagnóstico e identificación de C. fetus y sus subespecies (OIE, 2017). Sin embargo, este método presenta algunas dificultades: la alta contaminación con otros microorganismos de las muestras que se obtienen (esmegma prepucial, mucus vaginal y fetos abortados) (Lander, 1990), y condiciones microaerofílicas específicas que se requie-ren para su crecimiento, acompañadas de un lento desarrollo, entre otras. Las dificultades de crecimiento y la falta de reproducibilidad de las técnicas de cultivo motivaron el desarrollo de herramientas de diagnóstico molecular. Se han evaluado diferentes técnicas de PCR para la correcta identificación de la especie y las subespecies de Campylobacter fetus (Hum et al., 1997, Abrilet al., 2007; Van Bergen et al., 2005) con aspectos en común pero también con algunas diferencias (van der Graafvan Bloois et al., 2013). El objetivo de este trabajo fue esti-mar la sensibilidad y especificidad de una técnica de PCR en tiempo real (qPCR) comparándola con el cultivo de Campylobacter fetus (gold standard), utilizando la mismamuestra de esmegma prepucial para ambas técnicas.

Se obtuvieron muestras de esmegma prepucial de 315 toros diferentes, de 62 establecimientos. Se realizaron en total 12 muestreos: 4 en distintos establecimientos con sospecha de la enfermedad (donde se obtuvieron muestras de esmegma prepucial de 70 toros); y 8 en frigoríficos (donde se obtuvieron muestras de esmegma prepucial de 245 toros, de 58 establecimientos diferentes). Todas las muestras se procesaron y analizaron siguiendo el mismo protocolo: se sembraron 150 µL de la muestra en Medio Skirrow (OIE, 2017), se incubaron a 37 °C en atmósfera microaerofílica (CampyGen®, 5-10% de oxígeno, 5-10% de dióxido de carbono y 5-9% de hidrógeno) durante 48 horas. Las colonias sospechosas se observaron al microscopio por contraste de fases y se resembraron en medio de culti-vo agar sangre Columbia para obtener el aislamiento de C. fetus. Las subespecies de las cepas se identificaron fenotípicamente por la prueba de tolerancia a glicina al 1% y la prueba de producción de sulfuro de hidrógeno (H₂S) en un medio con Triple Sugar Iron (TSI) (OIE, 2017). A su vez, se realizó la qPCR (Iraola et al., 2016): se utilizaron un par de pri-mers que amplifican una secuencia de 78 pb del gen 16S rRNA y una sonda TaqMan-MGB que se dirige a una región polimórfica de 19 pb que detecta cepas de C. fetus para diferen-ciarlas de otras especies de Campylobacter y de otras bacterias. Se realizó la extracción de ADN con un método de fastboiling (Schunck et al. 1995) a partir de 500 µL de esmegma prepucial en PBS. Las muestras se agruparon en pooles de 5 muestras. La qPCR se realizó con un volumen final de 25 μL: 1 × TaqMan Genotyping Master Mix (Applied Biosystems, Foster City, EE. UU.), 1 × Custom TaqMan SNP Genotyping Assay (0,9 μM cada primer y 0,2 μM de la sonda) y 1 μL del ADN correspondiente a un pool de muestras. El ciclado se realizó en un equipo ABIPrism 7500 (Applied Biosystems). Cuando se detectaba un pool positivo, se repetía la qPCR con cada muestra individual para identificar la muestra positi-va. Se calcularon la sensibilidad y especificidad de la qPCR y el valor de concordancia kappa (Thrusfield, 1995) entre el cultivo y laqPCR, utilizando el software Epidat 3.1. La estimación del porcentaje de positivos se realizó por el método de Wilson Score, estableciendo la media estimada, y los rangos entre el límite inferior y el límite superior, con un intervalo de confianza del 95% (Wilson, 1927; Boom-sma, 2005).

Se obtuvieron 7 aislamientos de C. fetus, y 308 cultivos negativos. De estos 7 aislamientos, 6 se identificaron por pruebas bioquímicas como C. fetus venerealis y 1 como C. fetus fetus. En cuanto a la qPCR, se obtuvieron 9 reacciones positivas en muestras individuales. De los 62 establecimientos de origen, 6 fueron positivos por cultivo y 8 por qPCR. Para la estimación de la sensibilidad y especificidad de la qPCR, se tomó como referencia de “animales enfermos” a los positivos por cultivo y aislamiento, y se obtuvo una sensibilidad del 100% (entre 92,9% y 100%). A su vez, se tomaron como referencia de “animales sanos” a los negativos por cultivo, obteniendo una especificidad del 99,4% (entre 98,3% y 100%) con un intervalo de confianza del 95% (Cuadro I).

Cuadro 1: Sensibilidad y especificidad de la real time PCR.

En el trabajo de Iraola et al. (2016) se estimó un 100% de sensibilidad y especificidad; esta diferencia con nuestros resultados puede deberse a que los ensayos se realizaron a partir de cepas aisladas tanto de C. fetus como de otras bacterias. A su vez, García Guerra et al. (2014) obtuvieron 85,4% de sensibilidad y 85% de especificidad también a partir de muestras de campo, pero utilizando una qPCR para detección de subespecie C. fetus venerealis (Hum et al. 1997). En el presente trabajo, el valor de concordancia kappa obtenido al comparar ambas técnicas diagnósticas fue de 0,87 con un error estándar de 0,09 y un intervalo de confianza de 95%. Cuando el valor de ka-ppa es mayor o igual a 0,75 es considerado una excelente concordancia (Landis y Koch, 1977), por lo tanto la qPCR puede ser utilizada como técnica de screening. Se obtuvo una proporción de toros portadores de C. fetus de 2,2 % por cultivo, y de 2,9% por qPCR, sin encontrar diferencias estadísticamente significativas entre los dos resultados, con un intervalo de confianza del 95%. Los resultados de la proporción de positivos de C. fetus por cultivo son similares a los antecedentes nacionales (Repiso et al., 2005) de 2,6%, por lo tanto no parece que la prevalencia del patógeno haya aumentado, a pesar de que se sigue demostrando su presencia en nuestro país. Se obtuvo un porcentaje de establecimientos con presencia de C. fetus de 9,7% por cultivo, y del 12,9% por qPCR, sin encontrar diferencias estadísticamente significativas entre los dos resultados, con un intervalo de confianza del 95%. A pesar de considerar la desventaja de tener bajo número de positivos, se observa una diferencia con respecto al 20,5% (estimado sobre la base de 47 aislamientos positivos) reportado por Repiso et al. (2005).

La qPCR utilizada es una técnica de screening adecuada para la detección de C. fetus directamente a partir de muestras de esmegma prepucial de toros. Se sigue demostrando la presencia de C. fetus en nuestro país.