Efecto del tipo de alimentación en la abundancia relativa de diferentes géneros bacterianos ruminales

En los ruminates, los procesos de fermentación ruminal condicionan la digestión de los alimentos. Estos procesos son realizados por una compleja microbiota (bacterias, protozoarios, arqueas y hongos) que interactúa entre sí y con los sustratos presentes. Las especies bacterianas analizadas presentan funciones específicas y de interés a nivel ruminal. Es así que Selenomonas ruminantium es una bacteria consumidora de ácido láctico y ha sido identificada como un componente importante en los aislamientos ruminales realizados en Uruguay (Fraga et al., 2013). El Streptoccocus bovis es una de las principales bacterias productor de ácido láctico potencialmente asociado a acidosis y Fibrobacter succinogenes y Ruminococcus flavefaciens son géneros asociados a la microbiota celulolitica, responsable de la degradación de la fibra. El objetivo de este estudio consistió en determinar el efecto del tipo de alimentación (TMR, forraje fresco o ambos) sobre la abundancia ruminal de Selenomona ruminantium, Streptoccocus bovis, Ruminococcus flavefaciens y Fibrobacter succinogenes.

 

Nueve vaquillonas cruza de 214 ± 18 kg de PV fueron utilizadas en un diseño de 3 cuadrados latinos simultáneos de 3x3 y sometidas a tres tratamientos: ración totalmente mezclada (RTM) durante 24 h (T), RTM durante 18 h de + 6 h forraje fresco (T+F), y Forraje fresco durante 24h (F). La RTM (58% MS, 26% NDF, 56%CNF, 10% PC) y el forraje fresco (42% MS, 46% NDF, 28% CNF, 14% PC) fueron ofrecidos a voluntad durante el tiempo asignado. Cada período presentó una duración de 19 días (18 días de adaptación y 1 día de mediciones). Se extrajeron muestras de contenido ruminal (50 mL) a través de una sonda ruminal permanente (1 cm de diámetro y 50 cm de largo) dispuesta en el saco ventral del rumen. Las muestras fueron inmediatamente congeladas (-20 ºC) para su posterior análisis. La extracción de ADN fue realizada de acuerdo a Zhou y col. (1996) a partir de las muestras (10g) descongeladas a 4 ºC durante una noche y homogeneizadas mediante agitado manual. El ADN obtenido se evaluó mediante espectrofotometría, considerando las relaciones de absorbancia a longitudes de onda 260/280 y 260/230 (NanoDrop ND-1000 Spectrophotometer; NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA).

La cuantificación del contenido de ADN de las muestras se realizó por duplicado mediante PCR en tiempo real utilizando un ciclador (72 Rotor-GeneTM 6000, Corbett Life Sciences, Sidney, Australia) a 95°C x 5 min, luego 40 ciclos de 95°C x 5 segundos y, a 60°C x 10 segundos. Se utilizo SYBR® Green como fluoróforo. Los primers utilizados fueron específicos para Eubacterias y Ruminococcus flavefaciens (Denman y McSweeney 2006) y para Selenomonas ruminantium, Streptoccocus bovis y Fibrobacter succinogenes (Stevenson y Weimer, 2007). La eficiencia de amplificación (EA), calculada según Rasmussen (2001), fue de 0.87, 0.97, 0.98, 0.84, 0.75 para eubacterias y las diferentes especies respectivamente. La abundancia relativa (ΔΔCT) de cada genero bacteriano se calculó a partir de la ecuación propuesta por Pfaffl (2001) modificada; donde la Abundancia relativa (ΔΔCT) = [(EA genero)CT patron – CT muestra]/[(EA eubacterias)CT patron – CT muestra]. Se utilizó como muestra “patrón” a una mezcla de 4 muestras de contenido ruminal que fueron elegidas por su alta concentración de ADN y buena calidad.

El coeficiente de variación inter-ensayo fue de 18.4 %. Los coeficientes de variación intra-ensayo variaron entre 7.2 y 11.7. Los datos fueron analizados mediante un procedimiento mixto de SAS, considerando los efectos fijos del cuadrado, período anidado al cuadrado y del tratamiento, y el efecto aleatorio del animal.

En el Cuadro 1 se presenta la abundancia relativa de cada genero bacteriano según el tratamiento. El tratamiento F presento menor abundancia de Streptoccocus bovis, debido posiblemente a la menor disponibilidad de sustratos almidonosos. El acceso al forraje (F y T+F) generó una mayor abundancia de Fibrobacter succinogenes.

Cuadro 1. Abundancia relativa a una muestra patrón (ΔΔCT) de diferentes géneros bacterianos ruminales en vaquillonas alimentadas con RTM, forraje fresco o ambos.

Diferentes letras (a-b) en una misma fila difieren significativamente (P<0,05), (x-y) tendencia a diferencia entre tratamientos (P<0,10). 1 T = Ración totalmente mezclada 24h, T+F= Ración totalmente mezclada 18h + 6h Forraje fresco, F= Forraje fresco 24h. 2 Trat = efecto del tratamiento, P = efecto del período.

 

En estas condiciones experimentales el acceso a 6h de forraje fresco aumento la abundancia relativa de Fibrobacter succinogenes, sin modificar la abundancia de las especies productoras y consumidoras de ácido láctico respecto a una dieta RTM en vaquillonas.

 

Aguerre M., Cajarville C., Kozloski GV., Repetto JL. 2013. Intake and digestive responses by ruminants fed fresh temperate pasture supplemented with increased levels of sorghum grain: a comparison between cattle and sheep. Animal Feed Sci.and Technol. 186: 12-19.
Denman SE., McSweeney CS. 2006. Developmentofa real-timePCR assay formonitoring anaerobic fungal and cellulolytic bacterial populationswithin the rumen. FEMS Microbiol. Ecol. 58: 572–581.
Fraga M., Perelmuter K., Valencia MJ., Cajarville C., Zunino P. 2013. Caracterización de la microbiota bacteriana ruminal de un bovino a pastoreo mediante técnicas clásicas e independientes del cultivo. Veterinaria (Montevideo) 49:40-55.
Pfaffl M., 2001. A new mathematical model for relative quantification in real-time RT–PCR. Nucleic Acids Res. 29: 2002–2007.
Rasmussen R., 2001. Quantification on the Light Cycler. En Meuer S. Rapid Cycle Real-Time PCR. Methods and Applications (págs. 21–34).
Stevenson DM., Weimer PJ. 2007. Dominance of Prevotella and low abundance of classical ruminal bacterial species in the bovine rumen revealed by relative quantification real-time PCR. Appl Microbiol Biotechnol 75:165–174.