Aislamiento y uso de hongos nematófagos para el control biológico de nematodos gastrointestinales de bovinos en el sistema de producción de leche de Cundinamarca y Boyacá

En este capítulo se presentan los resultados del estudio "Aislamiento y uso de hongos nematófagos para el control biológico de nematodos gastrointestinales de bovinos en el sistema de producción de leche de Cundinamarca y Boyacá", realizado en el centro de investigación TibaitatáCeisa de Corpoica entre el 2000 y el 2013, financiado por Colciencias. En el estudio participaron los siguientes investigadores: Dildo Márquez Lara, Rocío Patiño Burbano, Fredy García Castro, Jaime Andrés Cubides Cárdenas, Diego Díaz Sabogal, Aldemar Zúñiga López, Yonattan Gómez Sánchez (QEPD).

El uso indiscriminado de antihelmínticos para controlar los nematodos gastrointestinales (NGI) en bovinos trajo consigo el surgimiento de consecuencias indeseables como: resistencia parasitaria, residuos químicos en alimentos, contaminación ambiental y agotamiento de los antihelmínticos químicos disponibles. Lo anterior ha presionado para que se transformen las prácticas convencionales de control de NGI del ganado hacia prácticas sostenibles. El control biológico de los NGI de bovinos, basado en el uso de hongos nematófagos, constituye hoy en el mundo la estrategia más promisoria para controlar sustancialmente estos endoparásitos en sistemas de producción ganadera (Beltrão et al., 2011). Este nuevo enfoque constituye una innovación tecnológica, cual es el desarrollo de un nematicida biológico en las heces de los bovinos y en las praderas.

Actualmente, en diversas partes del mundo se realizan esfuerzos para la investigación en esta temática: México (Mendoza et al., 2003), Brasil (Braga et al., 2011, Assis et al., 2013) y Argentina, Estados Unidos de América, Australia, Holanda (Eysker et al., 2006) y Francia, entre otros.

Dicho estudio se realizó en dos fases: 1) aislar, identificar y evaluar hongos nematógos en condiciones in vitro; 2) evaluar en condiciones in vivo los hongos que demostraron mayor capacidad nematófa en las condiciones in vitro.

La primera fase consistió en: a) aislar e identificar hongos nematófagos mediante claves morfológicas, b) evaluar in vitro la capacidad de nematofagia de los hongos identificados, con el fin de identificar los de mayor capacidad nematófaga, que pudieran servir como candidatos potenciales para el control de los NGI de rumiantes, c) identificar molecularmente (mediante PCR) hongos nematófagos como prueba confirmatoria de la identificación morfológica.

Se sembraron 900 muestras de suelo y/o heces de bovinos y ovinos mediante la técnica de rociado en agaragua. Tres días después se adicionaron larvas L3 de NGI de bovinos, ovinos o del nematodo de vida libre Panagrellus redivivus para estimular el crecimiento de los hongos. Los hongos que atraparon larvas L3 fueron transferidos a cajas con agaragua para purificar el cultivo, posteriormente a cajas con PDA (papa, dextrosa, agar) o AHM (agar, harina de maíz) para la producción masiva de estos hongos. Los hongos fueron identificados mediante claves morfológicas (Cook y Godfrey, 1964) y molecularmente mediante PCR. La capacidad predadora de los hongos se determinó mediante la fórmula:

Donde:

A = porcentaje de captura

x = número de larvas atrapadas

y = número de larvas libres

w = número de larvas enroscadas

z = número de larvas muertas

Se realizó un análisis de varianza (Anova), donde cada hongo depredador aislado fue un tratamiento, cada uno con 5 repeticiones utilizando los datos arrojados por la fórmula matemática que se implementó, una vez obtenidos los resultados, se estimó la diferencia entre los tratamientos mediante la prueba de Tukey determinando así cuál tratamiento fue el mejor.

En la segunda fase, se evaluaron en condiciones in vivo los dos hongos nematófagos que mostraron mayor capacidad nematófaga (A. oligospora y A. musiformis), durante seis meses. Para ello se emplearon 15 bovinos de cuatro meses de edad, repartidos en tres grupos de cinco animales: control no tratado y dos grupos tratamientos. A cada uno de los animales de los grupos tratamientos se les administró, cada tres días, 1x106 conidios y conidios/clamidosporas por kg de peso, de A. oligospora y A. musiformis, respectivamente. Los animales su ubicaron en tres parcelas con pasto kikuyo, separadas con cuerda eléctrica, y diariamente se les suministró agua y concentrado. El efecto antiparasitario de los hongos en los animales tratados se determinó realizando quincenalmente recuentos de huevos de nematodos gastrointestinales por gramo de materia fecal (hpg) y determinando el nivel de contaminación de las praderas con larvas L3 de NGI.

La identificación molecular se basó en la ampliación por PCR y posterior análisis de restricción de la región de 18S rDNA, el cual contiene secuencias espaciadoras entre las regiones codificantes conocidas como espaciadores internos de transcripción (ITS) (Ahrén et al., 1998). Los ITS y las regiones específicas fueron la base para el diseño de primers que permitieran identificarlos y clasificarlos. Se empleó ADN extraído a partir de micelios por fragmentación en nitrógeno líquido y fenol cloroformo según el protocolo modificado de Tigano-Milani et al. (1995). Se utilizó el Nanodrop Spectrophotometer ND 1000 junto con su programa ND 1000- 3.3 para la cuantificación de ADN.

Los productos de PCR se secuenciaron en 310 Geneticanalizer (secuenciador) de Applied Biosystems®. Finalmente, con la secuencia encontrada se empleó el programa BLASTN 2.2.26 (Zhang, Schwartz, Wagner y Miller, 2000), mediante el cual se realizó la comparación frente a las secuencias que estaba disponibles en el Genbank.

Teniendo en cuenta las repeticiones de las diferentes pruebas in vitro, se tomó cada repetición como una unidad experimental y cada hongo como un tratamiento para desarrollar un diseño de bloques completos al azar, siendo el bloque el tipo de larvas usadas para la prueba. Las comparaciones entre grupos se hicieron mediante Anova y prueba de Tuckey

De los hongos observados con capacidad para atrapar larvas de nematodos, los pertenecientes al género Artrhrobotrys fueron los que exhibieron mayor nematofagia y rápido crecimiento de trampas de captura en las cajas de petri con agar-agua, sembradas con muestras de heces o de suelo al inicio del experimento.

Estos criterios se tuvieron en cuenta para seleccionar a los que se someterían a la evaluación de sus capacidades nematófagas en condiciones in vitro. Se seleccionaron 17 hongos nematófagos, de los cuales 12 correspondieron a la especie A. oligospora, 1 a A. oviformis y 4 a A. musiformis (tabla 31). El predominio de A. oligospora en la región estudiada es concordante con la documentación internacional, que informa que este hongo es ubicuo y por esta razón es el hongo nematófago más estudiado (Saumell et al., 2008, Nagesh et al., 2009).

Las estructuras de captura de estos hongos fueron anillos simples, redes simples y, predominantemente, redes tridimensionales -consideradas las más eficientes- (Liu, 2009, Sagüés et al., 2011). Estas estructuras, junto con la morfología de los conidióforos, número de células, morfología y tamaño de los conidios y la formación o no de clamidosporas, indicaban que los asilamientos obtenidos corresponden a los señalados en la tabla 31.

Las pruebas de comparación evidenciaron diferencias significativas entre los hongos (P < 0,05), al realizar la prueba de comparación de medias de Tuckey, observándose que la nematofagia de los aislamientos XXIV, L1, COT 1C, TIB 37 A, TIB 36 B fueron superiores al resto de aislamientos. De acuerdo con el tiempo de inicio del desarrollo de trampas, la capacidad de nematofagia y la abundante formación de clamidosporas, el hongo A. musiformis fue superior a los demás aislamientos (superior a 99%), razón por la cual podría ser tenido en cuenta como candidato potencial para ser empleado como estrategia de control biológico en Colombia. La capacidad nematófaga exhibida por este aislamiento colombiano es superior a la documentada en algunos estudios reportados por la literatura internacional (Orozco et al., 2009).

 

Se logró estandarizar la técnica de PCR con primers especie–específico como secuencias ITS, siendo una técnica altamente sensible para los diferentes hongos pertenecientes al género Arthrobotrys spp. Se destaca que para los hongos de las especies A. oligospora (figura 42) y A. musiformis es una técnica que permite la identi - ficación precisa por especie.

Se identificaron cincos aislamientos de hongos (tabla 32), en los cuales se realizó la secuenciación tanto con primer forward como con primer reverse, para seleccionar la secuencia más útil para la identificación de los aislamientos.

La extracción de ADN bajo el proceso de maceración con nitrógeno líquido y posterior extracción con fenol– cloroformo resultó ser un proceso eficaz para realizar la extracción de ADN, pero muy lento y la calidad de ADN se podría mejorar implementando otro tipo de extracción como con columnas de filtración o Chelex (Haugland et al., 2002).

La identificación de secuencias de ADN desconocidas también se puede realizar comparándolas con bases de datos de secuencias de nucleótidos de taxones conocidos. El ADNr también contiene secuencias espaciadoras internos de transcripción (ITS) que presentan secuencias de bases con - servadas y que pueden utilizarse para la diferencia entre especies relacionadas o para evaluar diver - gencias genéticas (White, 1990). En este trabajo se comprobó la utilidad de la ITS en la identificación de hongos nematófagos, aun así sería deseable diseñar primers cada vez más espe - cíficos para cada especie y buscar la implementación de las técnicas más complejas como es la de PCR en tiempo real (Pathak et al, 2012).

En la prueba in vivo no se observaron diferencias estadísticamente signifi - cativas del efecto de los hongos so - bre los niveles de excreción de hpg y la contaminación de las praderas en los tres grupos, situación que pudo deberse a tres razones:

En el modelo de medidas repetidas en el tiempo, para la variable larvas no se encontraron diferencias signi - ficativas entre los grupos (P > 0,05). Sin embargo, en la figura 43 y la tabla 33 se observa que el número de lar - vas L3 recuperadas en las praderas fue menor en las parcelas de los grupos tratados que en el grupo no tratado, especialmente los tratados con A. musiformis. Es probable que esta tendencia se hubiera sosteni - do en el tiempo si el experimento hubiera sido de mayor duración.

 

A manera de conclusiones, puede mencionarse lo siguiente:

Con base en estos resultados, es conveniente enunciar algunas recomendaciones importantes: