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DETERMINACIÓN DE SUBTIPOS ZOONÓTICOS DE Cryptosporidium spp. EN TERNEROS CON DIARREA EN GALICIA

Publicado: 13 de enero de 2015
Por: Díaz, P.1*, Quílez, J.2, Soilán, M.1, Prieto, A.1, Pérez, A.1, Cabanelas, E.1, López, C.1, Fernández, G.1, Panadero, R.1, Díez-Baños, P.1, Morrondo, P.1 1 Investigación en Sanidade Animal: Galicia (GRUPO INVESAGA). Departamento de Patoloxía Animal. Facultade de Veterinaria. Universidade de Santiago de Compostela. 2 Departmento de Patología Animal, Facultad de Veterinaria, Universidad de Zaragoza.
Resumen

Cryptosporidium, uno de los agentes etiológicos más comúnmente implicados en procesos diarreicos en animales vertebrados, es un protozoo parásito identificado con frecuencia en ganado vacuno. Se ha comprobado que varias especies del protozoo identificadas en bovino poseen potencial zoonótico, es decir, pueden causar criptosporidiosis en humanos, sobre todo en personas inmunodeprimidas y en niños. Con objeto de conocer el potencial zoonótico de las especies/genotipos y subtipos del protozoo presentes en granjas de ganado vacuno con brotes de diarreas neonatales, se recogieron 345 muestras fecales de terneros menores de 30 días afectados por cuadros diarreicos. Los animales pertenecían a 199 granjas localizadas en diferentes zonas de Galicia. Sobre una selección de muestras positivas a microscopía (Heine, Ziehl-Neelsen) se realizó un análisis genotípico y subgenotípico con técnicas moleculares (PCR-RFLP del gen SSUrRNA y PCR del gen GP60, respectivamente).

Los resultados del estudio microscópico reflejaron que Cryptosporidium es un enteropatógeno causante de diarrea neonatal muy frecuente en ganado vacuno en la Comunidad gallega, ya que el 63% de las explotaciones y el 57% de los animales investigados resultaron positivos. Mediante técnicas de biología molecular se comprobó que todos los aislados obtenidos pertenecían a la especie Cryptosporidium parvum, con predominio de subtipos identificados anteriormente en humanos y, por tanto, potencialmente zoonóticos, como el IIaA15G2R1 (91%) y el IIaA16G3R1 (6%). En menor medida se halló el IIaA13G1R1 (3%). Teniendo en cuenta que un elevado porcentaje de los terneros menores de un mes afectados de diarrea eliminan ooquistes de Cryptosporidium que pueden causar la enfermedad en las personas, se recomienda que quienes estén en contacto directo con estos animales extremen las medidas de precaución para evitar la adquisición y/o diseminación de la infección.

INTRODUCCIÓN
Los criptosporidios se reconocen mundialmente como uno de los enteropatógenos implicados con mayor frecuencia en la aparición de procesos diarreicos en vertebrados. El parásito alcanza una gran importancia en ganado vacuno ya que varios estudios epidemiológicos transversales han comprobado que su presencia en los rebaños es notable, mientras que estudios longitudinales demuestran prevalencias acumuladas del 100%. La criptosporidiosis, más frecuente en terneros en sus primeros días de vida, se caracteriza fundamentalmente por diarrea, debilidad y anorexia, constituyendo una importante causa de pérdidas en las explotaciones. Aunque son varias las especies del parásito que pueden afectar al hombre, en la mayoría de los casos se encuentran implicadas dos especies, C. hominis y C. parvum. Si bien la primera es específica del ser humano, la segunda se ha identificado en numerosas especies animales, entre las que sobresale el ganado vacuno.
Las criptosporidiosis en rumiantes domésticos ha sido objeto de numerosas investigaciones en España, aunque la mayoría de los estudios no incluyen información sobre la variabilidad genética o su relación con el potencial zoonótico de los parásitos identificados al utilizar habitualmente técnicas microscópicas de diagnóstico (Ziehl-Neelsen, Heine, IFAT,...) que no permiten identificar las especies/ genotipos presentes, pues todas son morfológicamente indistinguibles. Sin embargo, en la última década se han desarrollado técnicas basadas en la biología molecular que permiten detectar y diferenciar Cryptosporidium hasta el nivel de genotipo/especie y subgenotipo. 
Estas herramientas, que se están empleando cada vez con mayor frecuencia en estudios epidemiológicos sobre criptosporidiosis, han supuesto un cambio importante en la información sobre la epidemiología y transmisión del parásito en humanos y animales. Este estudio se centra particularmente en la caracterización genética de aislados de criptosporidios obtenidos de terneros diarreicos menores de un mes, de modo que la identificación molecular de genotipos y subtipos nos permitirá conocer el potencial zoonótico de los aislados estudiados.

MATERIALES Y MÉTODOS
El estudio se realizó sobre 345 muestras de heces de terneros menores de 30 días que presentaban diarrea. Los animales pertenecían a 199 granjas localizadas en Galicia. Las heces se mantuvieron refrigeradas a 4ºC hasta su análisis. La identificación de los ooquistes de Cryptosporidium se realizó en  primer lugar mediante examen microscópico de preparaciones teñidas con carbol-fucsina (Heine). Las muestras negativas o dudosas se procesaron de nuevo, empleando la tinción Ziehl-Neelsen modificada. De las muestras positivas a microscopía se seleccionaron 155 para su posterior caracterización molecular. Los ooquistes de Cryptosporidium se concentraron y separaron de las heces mediante una técnica de flotación con solución salina saturada. Posteriormente, y con objeto de romper su resistente pared, los ooquistes se sometieron a tres pasos de congelación  (-196ºC) y descongelación (100ºC). El ADN se extrajo con un kit comercial específico y se conservó a −20ºC. Para determinar la especie/ genotipo de Cryptosporidium se utilizó la técnica PCR-RFLP (1), que consta de una PCR anidada que amplifica un fragmento del gen SSUrRNA y su posterior digestión con las enzimas SspI y VspI. La caracterización subgenotípica de los aislados identificados como C. parvum se realizó mediante PCR de un fragmento del gen de la glucoproteína GP60 (2). 
 
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos tras el análisis microscópico de las muestras fecales demuestran que, en Galicia, Cryptosporidium se encuentra implicado con mucha frecuencia en brotes de diarreas neonatales en terneros menores, ya que el 63% de las granjas y el 58% de los animales resultaron positivos. En España se ha señalado a Cryptosporidium como uno de los principales enteropatógenos causantes de procesos diarreicos en terneros neonatos, conjuntamente con otros patógenos infecciosos bacterianos y víricos (3), con prevalencias que en ocasiones superan hasta el 60% (3, 4, 5, 6, 7).
Mediante técnicas de biología molecular se comprobó que todos los aislados obtenidos de los terneros pertenecían a la especie Cryptosporidium parvum. Nuestros resultados coinciden con varios estudios realizados en España, que señalan a C. parvum como la única especie identificada en terneros diarreicos menores de tres semanas (6, 7). En este sentido, varios autores sugieren la existencia de una relación entre la edad y la presencia de determinadas especies de Cryptosporidium en el ganado vacuno, de manera que los terneros sin destetar están más predispuestos a la infección por C. parvum, responsables en gran medida de la aparición de importantes brotes de diarrea neonatal. Los animales con más edad parecen estar parasitados por especies más adaptadas al ganado vacuno y menos patógenas que C. parvum: en bovinos de 2 a 11 meses predominan C. bovis y C. ryanae, mientras que C. andersoni es la especie más importante en vacas de más de 1 año. La identificación de aislados de Cryptosporidium a nivel subgenotípico reveló que todos los aislados de C. parvum pertenecen a subtipos previamente identificados en humanos y por tanto, con potencial zoonótico. Concretamente, se observó el predominio del subtipo IIaA15G2R1 (91%), identificado por numerosos autores como la variante genética
de C. parvum más frecuente en terneros y humanos, junto con el subtipo IIaA16G3R1 (6%), menos frecuente en vacuno pero también descrito en humanos y finalmente el subtipo IIaA13G1R1 (3%) (8). En España, Quílez et al. (6) encontraron siete subtipos diferentes en terneros del norte de España, siendo de nuevo el IIaA15G2R1 el subtipo predominante.

CONCLUSIONES
- Cryptosporidium spp. es muy común en brotes de diarrea neonatal en ganado vacuno de la Comunidad gallega. Cryptosporidium parvum es la única especie encontrada.
- Un porcentaje elevado de terneros, menores de un mes y con diarrea, son portadores de subtipos zoonóticos de C. parvum, que junto a C. hominis se consideran las especies más comunes en brotes de criptosporidiosis humana, tanto en personas inmunodeprimidas como inmunocompetentes.
- Los terneros infectados representan una fuente de contagio potencial para el ser humano, por lo que las personas que están en contacto estrecho con ellos deberían tomar precauciones para evitar adquirir y/o diseminar la infección.

AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido financiado por el Proyecto de Investigación AGL2011-25210 (Ministerio de Ciencia e Innovación) y por una Ayuda para la Consolidación y Estructuración de Grupos de Investigación Competitivos (CN2012/326, Xunta de Galicia).
 
REFERENCIAS
1. Xiao L, Singh A, Limor J, Graczyk TK, Gradus S, Lal A. Molecular characterization of Cryptosporidium oocysts in samples of raw surface water and wastewater. App Environ Microbiol. 2001; 67: 1097-1101.
2. Alves M, Xiao L, Sulaiman I, Altaf A, Matos O, Antunes F. Subgenotype Analysis of Cryptosporidium Isolates from Humans, Cattle, and Zoo Ruminants in Portugal. J Clin Microbiol. 2003; 41: 2744–2747.
3. De la Fuente R, García A, Ruiz-Santa-Quiteria JA, Luzón M, Cid D, García S, et al. Proportional morbidity rates of enteropathogens among diarrheic dairy calves in central Spain. Prev Vet Med. 1998; 36: 145-52.
4. Quílez J, Sánchez-Acedo C, del Cacho E, Clavel A, Causapé AC. Prevalence of Cryptosporidium and Giardia infections in cattle in Aragón (northeastern Spain). Vet Parasitol. 1996; 66: 139-46.
5. Castro-Hermida JA, González-Losada YA, Ares-Mazás E. Prevalence of and risk factors involved in the spread of neonatal bovine cryptosporidiosis in Galicia (NW Spain). Vet Parasitol. 2002; 106: 1-10.
6. Quílez J, Torres E, Chalmers RM, Robinson G, Del Cacho E, Sánchez-Acedo C. Cryptosporidium species and subtype analysis from dairy calves in Spain. Parasitology. 2008; 135: 1613-20.
7. Díaz P, Quílez J, Chalmers RM, Panadero R, López C, Sánchez-Acedo C, et al. Genotype and subtype analysis of Cryptosporidium isolates from calves and lambs in Galicia (NW Spain). Parasitology 2010; 137: 1187-93.
8. Xiao, L. Molecular epidemiology of cryptosporidiosis: An update. Exp Parasitol. 2010; 124: 80–89.
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Autores:
Pablo Diaz
Universidade de Santiago de Compostela
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