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Evaluación del potencial inmunoprotector de sueros hiperinmunes anti-subolesin contra garrapatas rhipicephalus microplus

Publicado: 16 de agosto de 2019
Por: Pedro Noé Ramírez Guillen, Rodolfo Esteban Lagunes Quintanilla, Ned Iván de la Cruz Hernández, José Octavio Merino Charrez. Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Universidad Autónoma de Tamaulipas, Km. 5, Carretera Victoria-Mante, Cd. Victoria, Tam., México. CP 87000.Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria (CENID-PAVET, INIFAP).
Resumen

Se realizó una prueba de efectividad in vitro con un inmunógeno diseñado a partir de epítopos específicos de la proteína Subolesin, derivado de la secuencia inferida de Rhipicephalus microplus y obtenido de manera recombinante. Se utilizaron sueros hiperinmunes anti-Subolesin para observar el efecto protector contra garrapatas R. microplus, las cuales fueron alimentadas en un bovino procedente de una zona libre y mantenidas en condiciones de laboratorio para los ensayos de alimentación artificial capilar. Se formaron grupos de 10 garrapatas para evaluar el efecto de los sueros hiperinmunes de diferentes semanas con respecto a un grupo testigo.

Después del proceso de alimentación, las garrapatas ingurgitadas fueron pesadas para determinar la ingesta de sangre y mantenidas en incubadora para permitir la oviposición a las 2 semanas. Los resultados mostraron un efecto adverso en el peso y oviposicion de las garrapatas alimentadas con los sueros hiperinmunes, coincidiendo con el efecto inmunoprotector obtenido por Lagunes et al., (2016) 

Palabras clave: Rhipicephalus microplus, anti-subolesin, evaluación.

INTRODUCCIÓN
Las infestaciones de garrapatas son un problema muy frecuente en el ganado bovino de países tropicales y subtropicales. El control de estos ectoparásitos se basa principalmente por medio de ixodicidas. Sin embargo, el uso indiscriminado de estos productos ha generado la selección de poblaciones de garrapatas resistentes, quedando en el mercado pocas familias químicas que aún podrían utilizarse dentro de un programa de control. Por esta razón, se buscan alternativas que puedan ser utilizadas dentro de un programa de control integrado, como un componente más viable para el control de garrapatas, como es el control inmunológico basado en vacunas (de la Fuente y Contreras, 2015). 
El antígeno Subolesin, ha sido ampliamente estudiado por diferentes grupos de investigación, donde se ha observado que, al inmunizar bovinos, estos producen anticuerpos protectores que afectan los diferentes estadios de las garrapatas. Recientemente, Lagunes et al., (2016) sintetizaron un polipéptido recombinante basado en los epítopos de células B predichos en la secuencia de aminoácidos de la proteína Subolesin mediante análisis bioinformáticos, el cual fue evaluado en un ensayo preliminar de inmunización en bovinos contra garrapatas R. microplus. Dicha evaluación permitió observar una reducción en el número de garrapatas alimentadas sobre los bovinos inmunizados con el polipéptido.
Por lo cual, el objetivo del presente estudio es confirmar el efecto inmunoprotector del polipéptido de Subolesin mediante un ensayo de alimentación artificial capilar utilizando sueros hiperinmunes obtenidos de los bovinos previamente inmunizados con el fin de descartar variables externas que pudieran haber sesgado la eficacia del inmunógeno.
MATERIALES Y MÉTODOS.
El presente estudio se realizó en el laboratorio de Parasitología y Biología molecular de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia, Dr. Norberto Treviño Zapata, de la Universidad Autónoma de Tamaulipas. El material biológico utilizado fue la cepa de garrapatas R. microplus “Media Joya”, perteneciente al germoplasma del CENID-PAVET, INIFAP, y mantenida en condiciones controladas desde el 2009 en la FMVZ-UAT. Esta cepa fue aislada en el municipio de Tapalpa, Jalisco, México. Se utilizaron 8 muestras de suero hiperinmune obtenidos de 2 bovinos inmunizados con el polipéptido Subolesin, dichos sueros fueron evaluados mediante la técnica de ELISA indirecto para cuantificar los títulos de anticuerpos IgG anti-subolesin. Las muestras de suero fueron tomadas por pares la semana 0, 3, 5 y 7. Los sueros de la semana 0 (pre-inmune) fungieron como grupo control negativo, los sueros de la semana 3 con un nivel de anticuerpos de 0.7 OD405 nm, los de la semana 5 con 0.5 OD405 nm y el de la semana 7 presentaba el nivel más alto con 2.9 OD405 nm.
Se utilizó un bovino donador sin antecedentes de inmunización para extraer 100 ml de sangre en una bolsa recolectora con citrato de sodio, la sangre se dividió en 8 grupos y se mezcló con los 8 sueros respectivamente para llevar a cabo la alimentación artificial de las garrapatas. La relación de sangre-suero fue de 4:1 unidades. Con la finalidad de alimentar parcialmente las garrapatas R. microplus se utilizaron 2 bovinos procedentes de una zona libre de garrapata. Las larvas fueron alimentadas hasta el día 20 post-infestación, posteriormente fueron removidas, recolectadas y limpiadas. Se seleccionaron garrapatas con un peso entre 25-60 mg y que no presentaban daños en el aparato bucal para la formación de grupos experimentales y su posterior alimentación artificial capilar. Se tomaron 80 garrapatas con las cuales se formaron 8 grupos de 10 garrapatas para ser alimentadas con los sueros previamente mencionados. Los tubos capilares fueron reemplazados de acuerdo con el consumo de sangre aproximadamente cada 2-3 horas durante 48 horas de acuerdo a investigaciones previas (Antunes et al., 2014). Después del proceso de alimentación, las garrapatas ingurgitadas fueron pesadas nuevamente para determinar la ingesta de sangre, colocadas en viales para permitir la oviposición con temperatura y humedad controlada
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Los resultados obtenidos al finalizar el experimento se muestran en la Figura 1, donde se observa el peso final promedio de las garrapatas y el peso promedio de la masa de huevos ovipositados. Los grupos se formaron de acuerdo a la semana de inmunización de los bovinos de los que se obtuvieron los sueros. Por lo que se muestran cuatro grupos en la figura en lugar de ocho para una mejor apreciación de los resultados.
Evaluación del potencial inmunoprotector de sueros hiperinmunes anti-subolesin contra garrapatas rhipicephalus microplus - Image 1
En la semana 0, el cual representa el grupo control negativo (garrapatas alimentadas con sueros sin anticuerpos anti-subolesin) se observó una ingesta adecuada de sangre, aumentando la ganancia de peso de las garrapatas adultas al final del experimento; en cambio, a partir de la semana 3 y hasta la semana 7 se observan diferencias en los pesos obtenidos de los sueros de los dos bovinos. Se observó la presencia de 13 garrapatas muertas al término del experimento en los grupos de la semana 3, 5 y 7, posiblemente debido al efecto de los anticuerpos IgG anti-subolesin presentes en los sueros de ambos bovinos. En cuanto a la oviposición se observó un mayor peso en el grupo control, que este fue decayendo gradualmente hasta la semana 7, en este último de las 20 garrapatas, solo 4 ovipositaron.
De acuerdo con los resultados obtenidos en este estudio, se sugiere que la baja ganancia de peso de las garrapatas en las semanas 3, 5 y 7 así como la disminución gradual en la oviposición del grupo control al grupo 7 es debido al nivel de anticuerpos IgG anti-subolesin encontrados en las muestras de sueros obtenidos en ese período. Estos resultados concuerdan con los niveles de anticuerpos mostrada por Lagunes et al., (2016), donde se observa una respuesta inmune secundaria en los bovinos al momento de exponerlos a una segunda dosis del inmunógeno en cuestión. Por lo cual, la cantidad de anticuerpos circulantes en los animales era fácilmente perceptible y elevado.
En la Figura 2 se muestra una comparación entre el nivel de anticuerpos de los sueros antes mencionados con los resultados de este experimento. Los trabajos que se han realizado con la proteína Subolesin siempre han mostrado un efecto protector que ronda entre el 60% de eficacia general (Almazán et al., 2010; Merino et al., 2013), Sin embargo, no se había diseñado un inmunógeno a partir de la región antigénica que contuviera los mejores epítopos B predichos mediante programas bioinformáticos con la finalidad de aumentar el efecto inmunoprotector.
Evaluación del potencial inmunoprotector de sueros hiperinmunes anti-subolesin contra garrapatas rhipicephalus microplus - Image 2
CONCLUSIONES
Se concluye que el polipéptido Subolesin es inmunogénico y capaz de producir anticuerpos protectores. Esto sugiere que existió una reacción antígeno-anticuerpo específica y dirigida hacia los epítopos contenidos en esa región de la secuencia de la proteína Subolesin. 
A esta capacidad se le atribuye un efecto adverso en el peso de las garrapatas, por lo cual el desarrollo de antígenos vacunales basados en estudios de proteómica y bioinformática serán una tecnología de gran utilidad para el control integrado de las infestaciones de garrapatas que afectan a la ganadería bovina, disminuyendo la utilización de ixodicidas, evitando la contaminación ambiental y coadyuvando con la producción de alimentos inocuos.

Almazán C, Lagunes R, Villar M, Canales M, Rosario-Cruz R, Jongejan F, de la Fuente J. 2010. Identification and characterization of Rhipicephalus (Boophilus) microplus candidate protective antigens for the control of cattle tick infestations. Parasitology Research. 106: 471–479. 

Antunes S. Merino O, Mosqueda J, Moreno-Cid JA, Bell-Sakyi L, Fragkoudis R, Weisheit S, Pérez de la Lastra JM, Alberdi P, Domingos A, de la Fuente J. 2014. Tick capillary feeding for the study of proteins involved in tick-pathogen intercations as potential antigens for the control of tick infestation and pathogen infection. Parasites & Vectors. 7:42. 

de la Fuente J, y Contreras M. 2015. Tick vaccines: current status and future directions. Expert Review of Vaccines. 14: 1–10. 

Lagunes R, Domínguez-García D, Quiroz H, Martínez-Velázquez M, Rosario- Cruz R. 2016. Potential effects on Rhipicephalus microplus tick larvae fed on calves immunized with a Subolesin peptide predicted by epitope analysis. Tropical Biomedicine. 33: 726-738. 

Merino O, Antunes S, Mosqueda J, Moreno-Cid JA, Pérez de la Lastra JM, Rosario-Cruz R, Rodríguez S, Domingos A, de la Fuente J. 2013. Vaccination with proteins involved in tick-pathogen interactions reduces vector infestations and pathogen infection. Vaccine. 31: 5889-5896.

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Autores:
Rodolfo Esteban Lagunes Quintanilla
INIFAP México
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mauricio gomez acebey
26 de agosto de 2019
Buenos días, muy instructivo este articulo, ? pero pueden decir con que frecuencia fue administrado el Inmunógeno¿ .
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