La ventilación restringida durante la primer mitad de la incubación de huevos de gallina domestica (gallus gallus) aumenta la concentración plasmatica de cortisol a la eclosión.

La incubación artificial es uno de los procesos más importantes de la avicultura. Con el paso de los años, las aves han sido mejoradas genéticamente, el lapso de desarrollo de las mismas ha disminuido, de tal manera que actualmente se requiere un menor tiempo para que estas alcancen el peso adecuado para salir al mercado, sin embargo el periodo de tiempo necesario para que se realice el desarrollo embrionario aun es de 21 días, por lo tanto la proporción de tiempo que las aves permanecen en la incubadora es mayor con relación a la vida productiva total de las aves, por lo tanto el periodo de incubación representa una parte importante en la vida de las aves. (5)

En algunos estudios se ha determinado que la restricción de O2 durante la incubación se encuentra relacionada con el retraso del desarrollo embrionario, así como con la aparición de malformaciones congénitas en diversos órganos, disminución de la longitud del pico y malformaciones en ojo(7)(9). Se ha descrito que el aumento de CO2 y la disminución de O2 en algunas etapas críticas de la incubación generan problemas de desarrollo como hipertrofia y disminución del lumen de la arteria aorta, hipertrofia cardiaca izquierda, hipertrofia cardiaca derecha y aumento de tamaño del septo interventricular.

Por otra parte La relación aparente entre ventilación limitada durante los primeros 10 días de desarrollo embrionario, que corresponde prácticamente a la mitad del proceso de incubación, con la obtención de pollitos de mejor calidad se basa en el aumento progresivo de las concentraciones de CO2 desde las primeras 48 horas de incubación hasta el día 10 de desarrollo embrionario (DE) estas cantidades de CO2 generan tolerancia del embrión a este gas, se menciona la existencia de mecanismos epigenéticos que favorecen la velocidad de desarrollo del embrión, este evento fisiológico se ha evidenciado verificando los niveles de participación y cantidad proporcional de las hormonas triyodotironina (T3), tiroxina (T4), proporción T3/T4 y cortisol, las cuales en condiciones de ventilación limitada se ha observado aumentan o modifican su  concentración en el plasma en embriones a las 468 horas de incubación, en comparación a embriones que recibieron un régimen de incubación tradicional (1)(3).

El equilibrio hormonal entre T3, T4 y cortisol es de suma importancia para el desarrollo embrionario durante la incubación, ya que influye directamente en la tasa metabólica del embrión y por lo tanto en su supervivencia. 

En condiciones ambientales de incubación utilizando la ventilación limitada el aumento en las concentraciones plasmáticas de estas hormonas se encuentra correlacionada a periodos de estrés transitorios de los embriones generados principalmente por la hipoxia y la hipercapnia resultante, lo cual también se relaciona con la disminución en el tiempo total de la ventana de nacimientos, la posible explicación de este evento se debe a que al generarse en el embrión un estado de estrés existe un mecanismo neurológico de tipo quimosensible posiblemente a nivel de control apneutico que ante la deprivación de O2 acelera el rápido establecimiento de un canal de retroalimentación positiva entre hipotálamo, hipófisis y glándula tiroides, lo cual permite el aumento de los niveles de T3, T4 y consecuentemente a través de la activación adrenocorticotrópica de cortisol, esta substancia que a su vez tiene efecto directo sobre los pulmones, el efecto generado en el embrión hace que al percibir una disminución en el aporte de oxígeno, se disminuya el tiempo para el picaje interno en cámara y por lo tanto también el picaje externo del cascarón (8).

En nuestro país existen pocos estudios que refieran el uso de la restricción de oxígeno durante la incubación y sus efectos sobre el desarrollo embrionario por lo tanto es necesario establecer si existe una relación entre el aumento de CO2 al inicio de la incubación, la limitación de O2 durante esta etapa, producción hormonal de T3, T4 y cortisol, así como sus posibles repercusiones sobre el embrión durante el desarrollo embrionario tardío y la calidad del pollito eclosionado, número total de pollitos eclosionados, grado de calidad de los mismos, con la finalidad de relacionar estos resultados con la aplicación de un sistema de ventilación limitada al interior de las máquinas incubadoras durante los primeros 10 días de desarrollo embrionario y comprobar si representa un beneficio para los embriones y pollos eclosionados que han sido incubados bajo estas condiciones. 

 

Se formaron dos grupos experimentales que emplearon el mismo número y modelo de máquinas incubadoras en los cuales se evaluaron huevos incubables provenientes de estirpes ligeras Bovans White de 40 semanas provenientes de una granja comercial. En el primer grupo experimental (Tratamiento I) de ventilación limitada, desde el inicio de la incubación hasta el día 10 de incubación, las máquinas incubadoras fueron modificadas mediante un sellado del dámper y los exhaucios, lo cual permitió que las concentraciones de CO2 se incrementaran de forma natural y de manera paulatina al interior de las máquinas durante la primera mitad del desarrollo embrionario, posteriormente las máquinas incubadoras continuaron trabajando bajo condiciones ambientales estándar mediante el retiro de los sellos que se habían colocado previamente en las máquinas. 

El segundo grupo (Tratamiento II) se mantuvo durante todo el experimento bajo condiciones de ventilación estándar, permitiendo el ingreso continuo de aire fresco al interior de las máquinas.

En todos los experimentos, se determino la pérdida de humedad de los huevos de cada máquina al día 10 y 18 DE. Mediante la diferencia del peso inicial del huevo menos la diferencia al día 10 y 18 DE. Adicional a la determinación de la fertilidad de cada uno de los lotes de huevos fértiles asignados aleatoriamente a cada uno de los tratamientos, se evaluó la tasa de natalidad y porcentaje de incubabilidad. Posterior a la transferencia del huevo embrionado y a partir de las 468 horas, la ventana de nacimientos se evalúo cada dos horas mediante el registro en horas de incubación del primero hasta el último pollito eclosionado. 

La metodología de evaluación al nacimiento se realizó con base a una escala de calidad no invasiva con una calificación de 100 puntos como máxima puntuación, Se obtuvo un promedio de calificación en puntos por cada tratamiento de ventilación limitada y de ventilación estándar. De acuerdo al puntaje promedio obtenido de cada máquina se le otorgó una calificación de 100 puntos = Excelente, 85 a 99 = buena, 75 a 84= regular, 60 a 74= Deficiente y menor a 60 = inaceptable (4).

En embriones con 432 horas de incubación después de concluir la transferencia embrionaria a los 18 días de (DE) se seleccionó por medio de ovoscopía una muestra aleatoria de 5 huevos con embriones vivos a partir de cada máquina incubadora. En pollitos recién nacidos de igual manera se obtuvo una muestra aleatoria de cinco pollitos por máquina, inmediatamente después de concluir la medición de los parámetros de calidad. 

Se obtuvieron muestras sanguíneas por medio del corte de la vena central del saco vitelino en embriones y por decapitación cervical en pollitos recién nacidos, las cuales fueron colectadas en tubos con heparina, posteriormente las muestras fueron centrifugadas a 1,200 rpm a 4°C durante 10 minutos, el plasma obtenido fue colectado y almacenado a -20°C hasta el momento de realizar la medición (6).

Las concentraciones de T3 y T4 fueron medidas utilizando un kit comercial para la detección de T3 y T4 libre mediante pruebas de ELISA, la sensibilidad fue de 0.25pg/ 50 μl, el coeficiente de variación intra ensayo fue menor al 10% en ambas mediciones (6). 

Las concentraciones plasmáticas de cortisol fueron medidas utilizando una prueba de ELISA estandarizada a partir de muestras plasmáticas provenientes de pollitos provenientes de estirpes ligeras y pesadas, se empleó el anticuerpo R4866, la sensibilidad intra ensayo fue de 0.1pg/50μl el coeficiente de variación fue de 5.44% (6).

Se empleó un diseño completamente aleatorizado, en el cual se realizó un análisis de varianza de un solo factor (GLM) para el peso de los huevos al incubar, peso de los pollitos, pérdida de peso al día 10 DE y 18 DE; cuando hubo diferencia significativa, la diferencia entre medias de grupo se determinó por medio de la técnica de comparación múltiple de medias de Tukey a una significancia estadística de P<0.05. Los datos de los eventos de incubabilidad se transformaron al arcoseno de la raíz cuadrada de la proporción. Para determinar las probables diferencias entre los datos se sometieron a un análisis de varianza utilizando un GLM; cuando se detecto diferencia significativa entre tratamientos éstas fueron analizadas con la prueba de Tukey (P<0.05). Se utilizó el programa Statistical Analytical System (SAS) versión 9. 

 

El porcentaje de incubabilidad en el grupo de ventilación limitada fue de 60.76%±2.91 mayor (P<0.05) al 40.70%±2.21 observado en el grupo II. Se observó una tasa de natalidad el grupo I. de 49.99±3.33 % mayor (P<0.05) al 43.33±3.33% obtenidos en el tratamiento de ventilación estándar (Cuadro 1). 

El peso promedio del huevo al inicio del experimento fue de 53 gramos. Se observaron diferencias estadísticas significativas en el peso del huevo al día 10 de incubación, este fue de 48.96±2.1g para el tratamiento I, menor (P<0.05) que los 50.48±2.7 gramos que presento el tratamiento II. El porcentaje de pérdida de peso al día 10 fue de 7.27%±0.95 para el grupo I, mayor (P<0.05) al 5.91%±0.81 presentado en el tratamiento II. El promedio de peso del huevo al día 18 de incubación para el grupo I fue de 47.08±2.41 g, mayor (P<0.05) al 42.21±4.1 g del grupo estándar.(Cuadro 2) 

El inicio de la ventana de nacimientos fue a las 491±5.77 horas para el tratamiento I y de 492±5.29 horas para el grupo II sin diferencia estadística, al igual que en el termino y duración de la ventana de nacimientos (Cuadro 3). La longitud del pollito al nacimiento en el grupo I fue 16.99±0.49cm, mayor (P<0.05) a los 16.73±0.40 cm obtenidos en el tratamiento II. Respecto a la calidad del pollito al nacimiento, se obtuvo un mayor porcentaje de pollitos clasificados como de buena calidad en el tratamiento II, este fue de 40.80%, el tratamiento I obtuvo un 35.37% (P<0.05). Se observó la misma tendencia en los pollitos clasificados como de buena calidad, el tratamiento II presento un 50.85%, mayor (P<0.05) al 43.01 % obtenido en el grupo I de ventilación limitada. En los pollitos clasificados como de calidad regular el tratamiento I obtuvo un porcentaje de 21.80%, mayor (P<0.05) al 5.68% observado en el tratamiento II. En los pollitos calificados como de calidad deficiente en el grupo II se obtuvo un porcentaje del 2.85%, en el grupo I no se presentaron pollitos en esta clasificación. No se obtuvieron pollitos clasificados como de calidad deficientes en este experimento (Cuadro 4).

Las concentraciones de O2 tuvieron diferencias estadísticas al día 17 de incubación, estas fueron de 20.50±0.3% menor (P<0.05) en el grupo I, mientras que en el grupo II se registro una concentración del 20.26±0.05%. Las concentraciones de CO2 al día 10 de incubación fueron de 20,380±497ppm en el grupo I, mayor (P<0.05) a las 1,860.97±101ppm obtenidas en el grupo II. Se observo un aumento gradual en las concentraciones de CO2 durante la incubación.

Las concentraciones plasmáticas de T3 y T4 no fueron detectadas en el plasma proveniente de embriones de 18 días (DE). En pollito recién nacido se detectaron concentraciones en la hormona T3 de 725.55±899 ng/μl, menor (P<0.05) a los 2,900±2331 ng/μl detectados en el grupo de ventilación estándar. No se obtuvieron diferencias estadísticas significativas en las concentraciones de la hormona T4. Las concentraciones plasmáticas de cortisol fueron mayores en el tratamiento de ventilación limitada, estas fuerón de 119.45±74 ng/μl, mayor (P<0.05) a los 84.43±38 ng/μl registrados en el grupo II de ventilación estándar (Cuadro 5).

 

De Smit et al (2006) al utilizar la ventilación limitada para verificar el DE, encontró que los embriones del grupo experimental provenientes de tratamientos con aumento gradual de CO2 mostraban niveles significativos en la proporción de T3/T4 en el plasma. Bahadoran et al (2010) atribuye este incremento a un mecanismo de disparo fisiológico debido a un incremento previo de corticosterona, la cual es requerida para la conversión periférica de T3 a partir de T4, lo cual induce un aumento de triyodotironina; el incremento de corticosterona se dispara presumiblemente debido al estrés inducido por el aumento de la presión de CO2 interna y a la caída de la presión de O2 en la cámara de aire (hipoxia a los 12-14 DE) atribuida principalmente a este tipo de ventilación, aunque también existe la posibilidad de una activación en el sistema de retroalimentación positiva del hipotálamo, la glándula hipofisaria y una mayor respuesta de la glándula tiroides concomitante con un mayor desarrollo y actividad de la corteza adrenal con la finalidad de producir a su vez un mayor nivel de corticosterona en plasma (Smit et al, 2006),19 indicando posiblemente que un aumento de la presión de CO2 optimiza un mejor aprovechamiento del O2 disponible sobre todo en una etapa temprana del DE.

En este estudio las concentraciones plasmáticas de T3 y T4 no presentaron diferencias estadísticas significativas en pollitos recién nacidos, aunque estas fueron más elevadas en los tratamientos de ventilación estándar, únicamente se observaron diferencias estadísticas significativas en la concentración de cortisol plasmático, el cual fue estadísticamente mayor en el tratamiento de ventilación limitada; los resultados de este estudio se contraponen con los resultados descritos por De Smit et al (2006)19 quienes detectaron una concentración de cortisol mas elevada al momento del picaje interno comparada con las detectadas en los pollitos al momento del
nacimiento. 

Sin embargo, en el caso de los embriones de 18 días de (DE) dichas concentraciones no se pudieron detectar, a pesar de que se ha observado que existen niveles de T3 y T4 circulantes en embriones de 18 días de desarrollo embrionario, (Munro y Stabenfeldt 1984)79 esto probablemente se debe en parte al método de detección empleado, ya que a diferencia de las técnicas empleadas por los autores en comento la prueba de ELISA estandarizada es menos sensible que el uso de RIA. En embriones de 18 días de desarrollo embrionario solo se detectó cortisol plasmático.

De manera general las concentraciones hormonales detectadas en este estudio fueron numéricamente mucho mayores por unidad analizada a las detectadas por De Smit et al (2006)80, probablemente debido al tipo de metodología empleada para colectar el plasma y al método de detección empleado en este trabajo de investigación, ya que los autores emplearon punción intra cardiaca directa, mientras que en el presente estudio en embriones la sangre se obtuvo al cortar la vena central del saco vitelino y en pollitos recién nacidos por decapitación cervical.

Por lo tanto se concluye que la ventilación restringida durante la primera etapa de incubación permite el establecimiento de un mecanismo fisiológico que facilita una alta reactividad de los los niveles de cortisol plasmático ante los eventos de estrés severo como lo es el porceso de eclosión, lo cual favorece un aumento en la tasa de incubalidad.

 

Los autores agradecen a la Dirección General de Asuntos del Personal Acádemico (D.G.A.P.A- U.N.A.M) por el apoyo financiero otorgado para la realización del presente estudio por medio del proyecto PAPIIT IN 220909-3 “Evaluación del incremento de CO2 en la etapa temprana de incubación sobre el desarrollo embrionario en aves domésticas”. 

 

1. DE SMIT LD, BRUGGEMAN V, TONA JK, DEBONNE M, ONAGBESAN O, ARCKENS L, ET AL. Embryonic developmental plasticity of the chick: Increased CO2 during early stages of incubation changes the developmental trajectories during prenatal growth. Comp Bioch and Physiol: Part A 2006; 145:166-75. 

2. BAHADORAN S, HASSANZADEH M, ZAMANIMOGHADDAM AK. Effect of chronic hypoxia during the early stage of incubation on prenatal and postnatal parameters related to ascites syndrome in broiler chickens. Iranian J of Vet Res 2010; 11(1,):64- 71.

3. BRUGGEMAN V, WITTERS A, DE SMIT LD, DEBONNE M, EVERAERT N, KAMERS B, ET AL. Acid–base balance in chicken embryos (Gallus domesticus) incubated under high CO2 concentrations during the first 10 days of incubation. Resp Physiol & Neurobiol 2007; 159: 147- 54. 

4. LÓPEZ CS, JUÁREZ EMA, PRADO ROF. Una escala no invasiva para la clasificación de calidad en pollitos recién nacidos permite valorar el 201 proceso de incubación XXXIV convención ANECA 2009. Acapulco de Juárez (Guerrero); México A.N.E.C.A., AC. 1-9 pp. 

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