Toxina Shiga

La Tecnología IgY (uso de anticuerpos de yema de huevo) se encuentra en amplia expansión debido, principalmente, a los bajos costos de producción de las IgY con respecto a los anticuerpos mamíferos. Esta ventaja económica permite su aplicación no solo para el diseño de sistemas de diagnóstico sino también para la generación de productos para la prevención y tratamiento de diferentes enfermedades, tanto humanas como veterinarias (Chacana et al., 2004; Schade & Chacana, 2007). La Tecnología IgY ha sido exitosamente aplicada en ensayos para el control de diarreas neonatales, caries dentales humanas, úlcera gástrica causada por Helicobacter pylori, enfermedades de los peces, etc. (Schade et al., 2005). El Síndrome Urémico Hemolítico presenta un interés particular, ya que nuestro país tiene la mayor incidencia a nivel mundial con 500 casos por año en niños menores de 5 años (Rivas et al., 2010). La principal causa de esta enfermedad se debe a la infección con E. coli enterohemorrágica (EHEC), productora de las toxinas Shiga. En la actualidad, no existen estrategias específicas de prevención o tratamiento para evitar la infección por EHEC o medidas que prevengan sus complicaciones (Tzipori et al., 2004).
Como un primer paso para el diseño de un producto profiláctico o terapéutico, el objetivo de este trabajo fue la inmunización de gallinas ponedoras con la subunidad no tóxica Stx2B de la toxina Shiga, la purificación de los anticuerpos de yema de huevo producidos y la evaluación de la eficacia de las IgY para neutralizar la toxina.

Materiales & Métodos

Aves y plan de inoculación
Dos gallinas ponedoras Lohmann Brown de 16 semanas de edad fueron inmunizadas vía intramuscular según el siguiente plan de inoculación: día 0, día 15 y día 38, las aves fueron inmunizadas con 150 µg de Stx2B recombinante purificada; día 100 y día 130, las aves recibieron 200 µg de Stx2B recombinante purificada. La primera inmunización se llevó a cabo utilizando adyuvante de Freund Completo, mientras que para las siguientes se utilizó adyuvante de Freund Incompleto.

Recolección de huevos y purificación de IgY
Los huevos comenzaron a recolectarse luego de la tercera inmunización y los anticuerpos IgY presentes en la yema de huevo purificados mediante dos métodos: dilución con agua (Akita & Nakai, 1992) y precipitación con PEG (Polson, 1990). La capacidad de los anticuerpos IgY para reconocer a la holotoxina Stx2 fue analizada mediante Western Blot.

Actividad neutralizante de anticuerpos IgY
Se evaluó la capacidad de los anticuerpos para neutralizar los efectos tóxicos de Stx2 en células Vero (Gentry & Dalrymple, 1980). La toxina Stx2 (4 CD50) se pre-incubó con los anticuerpos purificados, durante 1 hora a 37°C. Posteriormente, se agregaron a la monocapa de células y se incubaron durante 48 hs a 37°C bajo atmósfera de 5% C0₂. Como controles se utilizaron la toxina sin anticuerpo y la toxina pre-incubada con los anticuerpos pre-inmunes. La viabilidad de las células Vero se determinó mediante tinción con cristal violeta y se midió la absorbancia a 490 nm. El porcentaje de neutralización se calculó utilizando la fórmula: DO (toxina + anticuerpo) - DO (toxina sin anticuerpo) / DO (sin toxina) - DO (toxina sin anticuerpo) x 100. Los resultados se expresaron como porcentaje de neutralización frente a la concentración de IgY total en µg/ml. Todos los datos están representados como el promedio de ensayos por triplicado.

Se obtuvieron anticuerpos IgY anti-Stx2B en yema de huevo con un título de 64.000 y un rendimiento de 8,4 mg de IgY/huevo. Estos anticuerpos no solo reconocieron la subunidad B de la toxina Shiga sino también la holotoxina Stx2 (Fig. 1).Por el método de dilución con agua se obtuvieron anticuerpos con menor cantidad de contaminantes que por precipitación con PEG (Fig. 2).

En cuanto a la capacidad neutralizante de los anticuerpos IgY totales, una concentración de 4,38 µg/ml fue suficiente para neutralizar 100% las 4CD50 de Stx2 (Fig. 3).

Figura 1. Western blot

A. Stx2B recombinante B. Holotoxina Stx2 (wild type)
La membrana se incubó con IgY anti-Stx2B (1/ 5000) y anti-IgY HRP (1/ 6000)
Flecha: posición de la subunidad B de Stx2

Figura 2. SDS-PAGE (12,5% en condiciones reductoras) de IgY purificada a partir de yema de huevo por el método de dilución con agua (A) y por precipitación con PEG (B)

Flechas posición de las cadenas pesadas (H) y livianas (L) de IgY

Figura 3. Neutralización in vitro de Stx2 (4CD50) con los anticuerpos IgY totales.

Los aves inmunizadas con Stx2B recombinante produjeron anticuerpos específicos en la yema de huevo a pesar de tratarse de una proteína pequeña (~11kDa). Estos anticuerpos IgY anti-Stx2B lograron reconocer a la holotoxina Stx2 de E.coli enterohemorrágica (EHEC) y neutralizar su toxicidad in vitro.
Por lo tanto, la Tecnología IgY se presenta como una alternativa económica y eficaz para disponer de anticuerpos en gran cantidad que puedan aplicarse tanto en profilaxis como en el tratamiento de pacientes infectados.

Akita EM & Nakai S.1992. Immunoglobulins from egg yolk: isolation and purification. J. Food Sci. 57:629.

Chacana PA, Terzolo HR, Gutierrez Calzado E, Schade R. 2004. Tecnología IgY o aplicaciones de los anticuerpos de yema de huevo de gallina. Revista de Medicina Veterinaria 85(5):179-189.

Gentry MK & Dalrymple JM.1980. Quantitative microtiter cytotoxicity assay for Shigella toxin. J Clin Microbiol. 12(3):361-366.

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Schade R, Gutierrez Calzado E, Sarmiento R, Chacana PA, Porankiewicz-Asplund J, Terzolo HR. 2005. Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): A review of progress in production and use in research and in human and veterinary medicine. ATLA 33(2):129-154.

Schade R & Chacana PA. 2007. Egg yolk compounds - Livetin fractions. pp. 25-32. En: Bioactive Egg Compounds. R. Huopalahti, Lopez-Fandiño R, Antón M, Schade R (Eds.). Springer, Germany.

Tzipori S, Sheoran A, Akiyoshi D, Donohue-Rolfe A, Trachtman H. 2004. Antibody therapy in the management of Shiga toxin-induced hemolytic uremic syndrome. Clin. Microbiol. Rev. 17:926-941.