Expresión soluble de la glicoproteína Espícula del virus de bronquitis infecciosa aviar usando el sistema de expresión de Baculovirus

Antecedentes:

Las vacunas producidas en huevo contra la bronquitis infecciosa aviar (BIA) no son siempre efectivas y causan efectos indeseados dentro de poblaciones de aves vacunadas, por lo que surgen como alternativa las vacunas basadas en proteínas recombinantes. La glicoproteína espícula (S) ha sido reportada como una de las proteínas más protectivas contra bronquitis. Nativamente, S es homotrimérica y su dominio extracelular se compone de dos subdominios (S1 y S2) que probablemente contienen epítopes, que estimulen efectivamente el sistema inmune del ave.  

Objetivo:

Expresar solublemente el dominio extracelular completo de la glicoproteína S de bronquitis, para posteriormente usarla como vacuna y para diagnóstico.

Metodología:

Usando el sistema de expresión de baculovirus hemos generado una glicoproteína S soluble, derivada de la cepa Mass41 de bronquitis, modificada en el C-terminal con la secuencia de trimerización (“foldon”) de la fibritina proveniente del bacteriófago T4 para estabilizar la triple hélice. Para lograr esto, se amplificó por PCR el dominio extracelular de S. Los primers forward y reverse contenían en sus extremos 5´sitios de restricción para BamHI y NheI, respectivamente, para ser clonado en un pAcGP67A (BD Bioscience), provisto por el Dr. Vikram Vakharia, el cual contenía el sitio de corte de la trombina, el “foldon” y 6x His-tag en su extremo 3´. La transfección y obtención de baculovirus recombinante fue realizada según instrucciones del fabricante. Grandes stocks de virus fueron obtenidos inoculando células SF9 al 50% de confluencia, con MOI (multiplicidad de infección) menor a 0.2 durante cuatro días, luego se concentró el virus del sobrenadante por ultracentrifugación y fue resuspendido en PBS. La expresión soluble de la proteína se realizó en medio libre de suero y fue comprobada por Western Blot.
 

Resultados:

La expresión de S en medio libre de suero fue exitosamente identificada por una reacción positiva al cromógeno HRP de un anticuerpo monoclonal anti His-tag y a suero de pollo específico anti-bronquitis, que se visualizó como una banda de alrededor de 180kDa.