Evaluación de la protección cruzada entre 3 cepas del serovar b de avibacterium paragallinarum.

Dentro de las enfermedades aviares Avibacterium paragallinarum, es el agente causal de la Coriza Infecciosa (AC). Esta enfermedad es un problema clínico frecuente, sobre todo en pollos que son destinados a postura. En la Coriza clásica no complicada las lesiones generalmente quedan confinadas al tracto respiratorio superior. La sinusitis puede estar asociada a inflamación de barbillas, conjuntivitis o queratitis. Debido a la resistencia de antibióticos se recomienda en zonas endémicas el control de la enfermedad con el uso de vacunas (4). Dentro de las prácticas que se han descrito como auxiliares para lograr reducir las pérdidas que la Coriza infecciosa ocasiona a las parvadas se encuentran la bioseguridad, medicación y vacunación, siendo esta última el mejor método para prevenir la afectación de las parvadas no por detener la infección, sino por disminuir la presencia de signos clínicos y reducir dramáticamente la excreción y dispersión de la bacteria. Actualmente existen vacunas formuladas con tres serovares de A. paragallinarum, A, B y C; y dentro del serotipo B hay vacunas que contienen hasta 3 cepas diferentes. En la actualidad existe controversia sobre la inclusión o no de cepas autógenas en las formulaciones de vacunas contra AC, ya que existen reportes de la necesidad de adicionar cepas autógenas de la región para formular las vacunas (5; 6). Adicionalmente se ha reportado que la protección cruzada entre los mismos serovares de B ha sido poco efectiva produciendo sólo una pequeña protección cruzada entre los mismos (1). El objetivo de este estudio fue determinar el porcentaje de protección que confieren las 3 cepas del Serovar B, contra desafíos cruzados (prueba de protección cruzada), utilizando las cepas presentes en la formulación de una vacuna contra AC que contiene 5 cepas diferentes. 
 

Este fue un estudio clínico en pollos libres de patógenos específicos (SPF) de 6 semanas de edad. El estudio se condujo bajo condiciones controladas de laboratorio. Se utilizaron 3 productos de investigación veterinaria formulados para conferir protección contra el serovar B de A. paragallinarum; así mismo, se incluyó una vacuna comercial como control positivo y un grupo sin tratamiento como control negativo. La respuesta inmune fue monitoreada por medio de la técnica de inhibición de la hemoaglutinación (HI). Para la demostración de la protección de cada formulación contra las tres cepas B se realizó una prueba de desafío con un período de observación de 7 días. Cada grupo de pollos fue considerado como una unidad experimental debido a que el análisis (Análisis de varianza -ANOVA) del promedio de los niveles de anticuerpos y el registro del nivel de afectación es suficiente para determinar la diferencia entre grupos. Además se realizó el reaislamiento de Avibacterium paragallinarum posterior a la eutanasia de los pollos. 

Se formaron 5 grupos experimentales (grupo del 1 al 5) con 30 pollos cada uno (excepto por el grupo 4 donde se tuvieron 31 pollos), posteriormente cada uno de estos grupos fue subdividido en 3 grupos (a, b y c) de 10 pollos cada uno para la evaluación de la protección ante el desafío con cada cepa de la fracción B. Los pollos de los grupos 1, 2, 3 y 5 fueron vacunados con el producto de investigación veterinaria o producto control correspondiente, a las 6 y 8 semanas de edad con una dosis establecida de1 x 108 UFC/dosis vía subcutánea en el tercio medio posterior del cuello. Adicionalmente, el grupo 4 se mantuvo sin ningún tratamiento y posteriormente fue desafiado.

Los pollos se mantuvieron en observación durante 2 semanas después de la primera vacunación y 3 semanas después de la segunda vacunación. Los pollos fueron mantenidos en diferentes unidades de aislamiento, de acuerdo al diseño experimental Tabla 1 y cada una de estas unidades fue identificada individualmente. Se tomaron 30 muestras al azar de los 151 pollos previo a la distribución de los grupos, estas fueron consideradas como el muestreo basal serológico. Se realizaron los dos muestreos serológicos más a las 8 y 11 semanas de edad de todos los pollos de cada uno de los grupos experimentales, Los pollos de todos los grupos fueron desafiados a las 12 semanas de edad (3 semanas después de la segunda vacunación), los signos clínicos fueron observados y determinados por el investigador por un periodo de 7 días después del desafío. Posteriormente a la eutanasia de los pollos se realizó el reaislamiento de AC de todos los pollos, se cortaron las cabezas y se identificaron individualmente, estas fueron trasladadas al laboratorio donde se realizó el reaislamiento; por medio de una toma con el asa bacteriológica directamente de los senos nasales.

Al grupo experimental 1 se les administró el PIV-1 (vacuna monovalente AC cepa BI); al grupo 2 se le administró el PIV-2 (vacuna monovalente AC cepa BII); al grupos 3 se le administró el PIV-3 (vacuna monovalente AC cepa BIII); al grupo 5 se le administró el PC (Vacuna monovalente comercial). El grupo 4 no recibió tratamiento y sólo se utilizó como control negativo para validar la prueba evaluando el porcentaje de morbilidad. 

Técnica de Desafío:
Para la evaluación de la fracción de AC, se llevó a cabo la prueba de potencia desafío 3 semanas posteriores a la segunda vacunación. De acuerdo a lo previamente establecido en la tabla 1 cada grupo fue identificado como a), b) y c) de acuerdo a la cepa con la cual fueron desafiados. 

Los grupos experimentales 1a), 2a), 3a) 4a) y 5a) fueron desafiados con la cepa BI; los grupos 1b), 2b), 3b) 4b) y 5b) con la cepa BII; y los grupos 1c), 2c), 3c) 4c) y 5c) con la cepa BIII. A partir del sobrante de inoculo empleado se determinaron las unidades formadoras de colonias sembrando en placas de base de agar con 10% de sangre de ovino y en placas de medio Balcrace. 

Desafío:
1) Desafío: Todos los pollos fueron desafiados por instilación nasal con una dosis de 0.2 ml, (0.1 ml de inóculo por narina) de Avibacterium paragallinarum, de acuerdo al diseño experimental.. Los títulos para el desafío fueron los siguientes:

BI:                            1x10^8.1 UFC/ml
BII:                           1x10^7.1 UFC/ml
BIII:                          1x10^7.9 UFC/ml

2) Periodo de observación: El periodo de evaluación post-desafío fue de 7 días, en los cuales se registró diariamente los signos clínicos en el formato de “Registro de Observaciones Clínicas Post-desafío AC”, apéndice 4. Los signos clínicos fueron evaluados de acuerdo a la escala 0 – 4 propuesta por Soriano y Terzolo, 2004 (3). (Tabla 2).

La vacuna se consideró como protectiva sólo si al menos el 80% de los pollos han sido protegidos, de acuerdo con los siguientes criterios:

1) El pollo no presenta signos clínicos durante el período de observación.
2) El pollo presenta signos clínicos hasta el 50% de los días de observación (no importa el grado de la escala), pero la puntuación media de daño de este pollo es menor que la media de puntuación del promedio de daño en el grupo control no vacunado y desafiado con la misma cepa (virulencia).

Condiciones:
A) Entre los grupos vacunados y no vacunados debe existir diferencia estadística significativa en el grado de virulencia.
B) La morbilidad de los grupos no vacunados después del desafío debe ser superior al 80%, esto para validar la prueba. 

Los niveles de anticuerpos contra cada uno los serotipos de A. paragallinarum, incluyendo las 3 cepas del serotipo B, fueron determinados a través de la técnica serológica de inhibición de la hemoaglutinación (HI), siguiendo el protocolo
usado en el Centro de Investigación y Estudios Avanzados en Salud Animal (CIESA).

Para el aislamiento se tomó una muestra con un asa bacteriológica, de los senos paranasales, realizando un corte sagital de la parte superior del pico con la finalidad de exponer los senos nasales, esto fue realizado en condiciones de esterilidad, utilizando un mechero Bunsen. Posteriormente, se sembraron en agar sangre junto con una cepa nodriza de S. aureus. Las cajas fueron incubadas en condiciones de 37°C con CO2 al 5%, y fueron observadas después de 24 y 48 hrs de incubación 

Se realizó la evaluación mediante la prueba estadística que reflejara de mejor manera los resultados. Para el caso de porcentajes de protección y reaislamiento se decidió realizar una prueba de Chi cuadrada y su comparación por medio de la prueba de Kruskal Wallis; para el caso de nivel de daño y títulos serológicos la prueba elegida fue un Análisis de Varianza (ANOVA) entre grupos, con un nivel de probabilidad de ≤0.05. En los casos donde se determinó diferencia estadística significativa, la comparación entre medias de los grupos experimentales fue realizada a través de una prueba de Tukey o contrastes ortogonales (según el criterio del estadista). Se utilizó el software SAS release 8.2 (2001) (SAS, Cary, North Carolina: SAS Institute Inc).

La unidad experimental y estadística fue cada grupo y los tratamientos fueron comparados entre sí. La hipótesis nula fue que no existe diferencia en el porcentaje de protección y nivel de anticuerpos entre las tres cepas de B a evaluar. La hipótesis alterna es que los grupos no son iguales en el porcentaje de protección y el nivel de anticuerpos. 

Resultados:
Porcentaje de protección:
Se calculó el porcentaje de protección con base a los criterios descritos en el apartado de Materiales y Métodos, todos los grupos vacunados mostraron protección ante el desafío aunque a diferente nivel, el rango de protección fue de entre 50 al 100%. Es importante hacer mención que los tres subgrupos no vacunados alcanzaron valores de afectación mayores al 80%, lo que valida la virulencia de las tres cepas que se utilizaron para el desafío, además los subgrupos vacunados con el producto comercial alcanzaron porcentajes de protección arriba del 80%. Por lo tanto, con base a estos 2 hallazgos se considera que la prueba cumplió con el criterio de efectividad del desafío. Un resumen de los resultados de porcentaje de protección se muestra en la grafica 1.

Con el objetivo de evaluar si existe diferencia estadística significativa en los valores de porcentaje de protección encontrados en éste estudio, se realizó la prueba de Kruskal-Wallis donde el valor de Probabilidad de la Chi cuadrada fue de 0.0236, lo cual indica que los grupos son diferentes. Por lo tanto, se decidió realizar la comparación entre grupos mediante la prueba de LSMeans (t-test). Los resultados muestran, al igual que Kruskal- Wallis, diferencia estadística significativa entre los grupos, siendo el Grupo No vacunado diferente a todos los demás grupos ya que presenta los valores de protección más bajos; le siguen en nivel de protección los grupos vacunados con monovalentes de BI y BIII, respectivamente. Los valores más altos de protección los muestran los grupos vacunados con la vacuna comercial y Monovalente BII, los cuales no presentan diferencia estadística significativa entre ellos, pero si muestran diferencias estadísticas con las dos a alguno de los otros dos productos monovalentes(Tabla 3y Grafica 1).

En la Grafica número 1 se muestran los porcentajes de protección conferidos por cada grupo experimental, la vacuna Comercial y la vacuna monovalente de la cepa BII son los que muestran el mayor porcentaje de protección contra las tres cepas B de AC.

Gráfica 1. Porcentaje de protección por grupo experimental

Resultados de reaislamiento 
Los resultados muestran una relación inversamente proporcional entre porcentaje de reaislamiento y porcentaje de protección (visualizados en la gráfica 2); es decir, a mayor porcentaje de protección fue más difícil lograr el reaislamiento de Av. paragallinarum y viceversa; en los grupos con menor protección fue más factible realizar el reaislamiento. El porcentaje de reaislamiento se observó en un rango de entre 0 al 90%. Con el objetivo de evaluar si los grupos son semejantes o diferentes desde el punto de vista estadístico, se realizó la prueba de Kruskal-Wallis donde el valor de Probabilidad de la Chi cuadrada fue de 0.0176, lo cual indica que los grupos son diferentes. Por lo tanto se decidió realizar la comparación  entre grupos mediante la prueba de LS Means (ttest). Los resultados de porcentaje de reaislamiento muestran que el mejor comportamiento se observó con el grupo inmunizado con la vacuna comercial y la vacuna Monovalente de la cepa BII, en los que se logró el menor porcentaje de reaislamiento, no existiendo diferencia estadística significativa entre ellos. Para el caso de la vacuna Monovalente BIII, fue la que presentó el mayor porcentaje de reaislamiento, no existiendo diferencia estadística entre este grupo y el no vacunado (Tabla 4 y Gráfica 2).

Resultados de grado de afectación medido por signos clínicos (Virulencia) 

En la gráfica 3 se resumen los resultados de Virulencia. Cuanto menor fue el puntaje del promedio del daño por grupo mayor será su protección. Los resultados muestran que los grupos no vacunados presentaron el mayor nivel de daño, con un valor promedio mayor de 1.22; mientras que en los grupos vacunados se observaron valores de daño promedio más bajos que el grupo no vacunado. El rango fue de 0 a 0.9. Destacan los grupos vacunados con vacuna comercial y el grupo de Monovalente cepa BII como los que presentan el menor nivel de daño. Con el objetivo de determinar si la diferencia en valores de daño entre grupos tiene significancia estadística, se realizó la prueba de Análisis de Varianza (ANOVA) seguida de una prueba de contrastes ortogonales.

Los resultados obtenidos después del análisis estadístico (tabla 6) muestra que cuando los pollos fueron vacunados con la vacuna que contenía la cepa BI el nivel de protección en contra de la cepa de BII es menor que cuando la cepa homóloga se utiliza como vacuna pero no hay diferencia estadística en el nivel de protección que confiere BI contra la cepa BIII.

Cuando los pollos fueron vacunados con la vacuna monovalente de BII, el nivel de protección contra BI y BIII es aún mejor que el nivel de protección que se logra con las cepas homólogas en sus correspondientes vacunas.

Cuando los pollos fueron vacunados con la cepa BIII el nivel de protección contra BI es menor (0.9) comparado con la cepa homóloga cuando se utiliza en la vacuna monovalente (0.73). 

Los resultados arrojados por la prueba estadística de contrastes octagonales, nos muestran que vacunando con la monovalente de BI hay protección contra BIII pero no contra BII; mientras que al vacunar con la monovalente de BII no es posible proteger contra BI pero si es posible proteger contra BIII; finalmente cuando se utiliza la monovalente de BIII no es posible proteger contra BI y BII ya que se muestran diferencias estadísticas significativas.

Adicionalmente los resultados muestran que no existe diferencia estadística significativa en los resultados del nivel de protección entre la vacuna comercial y la vacuna BI monovalente cuando se compara con su respectivo grupo de desafío. De acuerdo con los resultados no hay suficiente protección cruzada entre las cepas BI y BII, debido que no es posible alcanzar el mismo nivel de protección cuando la cepa homóloga se utiliza como vacuna. Sin embargo, BI es capaz de proteger contra BIII en el mismo nivel que la cepa homóloga. 
 

Serología resultados del segundo sangrado:

 Los resultados de las comparaciones en el promedio de los títulos de anticuerpos contra Avibacterium paragallinarum entre los grupos experimentales se muestran en la tabla 5 y la gráfica 4.

El análisis de varianza de los datos indican que hay diferencia estadística altamente significativa entre grupos experimentales (P<0.0001). La prueba de Tukey calificó que todos los grupos vacunados son diferentes estadísticamente al grupo 4 no vacunado; los valores más altos se presentaron en el grupos vacunados con el (PC) y PIV2, entre los cuales no existe diferencia estadística, en orden descendente siguen los grupos experimentales PIV1 monovalente de BI y PIV3 Monovalente de BIII que no son estadísticamente diferentes entre ellos pero sí lo son a los grupos PC y PIV2. 

El valor más alto se presentó en el grupo PIV2 que es estadísticamente diferente a todos los 4 grupos experimentales restantes; en orden descendente sigue el grupo experimental vacunado con la vacuna comercial (PC) que es estadísticamente diferente a todos los otros grupos experimentales, y en último lugar se encuentran los grupos experimentales PIV1 y PIV3, que no son estadísticamente diferentes entre ellos pero sí lo son a los grupos no vacunados, PC y PIV2. 

Los valores más altos se presentaron en los grupos PIV2 y 5 vacunado con (PC), entre los cuales no existe diferencia estadística; en orden descendente sigue el grupo experimental PIV3, el cual no presenta diferencia estadística con el grupo PC pero sí con los demás grupos experimentales, y finalmente el grupo PIV1 que es estadísticamente diferente a los 4 grupos restantes.

Los títulos se expresan como el inverso de la mayor dilución de la muestra que mostró una inhibición completa de la actividad hemaglutinante. Los títulos de anticuerpos HI, fueron transformados a logaritmos base 10 para eliminar cualquier sesgo en los datos. Diferentes literales en la columna indican diferencia estadística significativa por la prueba de Tukey.

En la grafica 4. Los títulos se expresan como el inverso de la mayor dilución de la muestra que mostró una inhibición completa de la actividad hemaglutinante. Los títulos de anticuerpos HI, fueron transformados a logaritmos base 10 para  eliminar cualquier sesgo en los datos. 

Al realizarse el análisis del porcentaje de pollos con títulos HI mayores a 5 (considerados protectivos), se aprecia que los grupos que fueron vacunados con PC y PIV2 alcanzaron los mejores porcentajes de protección, siendo el mismo nivel entre ellos (100% BI, 96.7% BII y 100% BIII). El grupo vacunado con (PIV1) muestra el 96.7% de protección con su antígeno homólogo; sin embargo, con los otros dos antígenos (BII y BIII) sólo alcanza el 46.7% de pollos con títulos protectivos. Finalmente, el grupo vacunado con (PIV3) monovalente 4143, mostró más del 90% de los pollos con títulos protectivos para las cepas BI y BIII, pero contra el antígeno BII sólo alcanzó el 23.3%
 

Discusión:
En relación al porcentaje de protección los resultados muestran que con excepción de la vacuna Monovalente de BII, ningún otro de los 2 prototipos monovalentes logró el mismo nivel de protección que la vacuna comercial que cuenta con las tres cepas de B en su formulación, además la vacuna monovalente de BII es la que mostró el más amplio espectro de protección contra las cepas B heterólogas.

En relación al porcentaje de reaislamiento se puede concluir que parece existir una correlación entre protección y reaislamiento ya que los grupos con mayor porcentaje de protección fueron los que presentaron el menor número de pollos positivos a reaislamiento y, de manera contraria, los menos protegidos tuvieron los más altos porcentajes de reaislamiento. Los resultados concuerdan haciendo referencia a los grupos control no vacunados, donde se obtuvo el mayor porcentaje de reaislamiento con las tres cepas de desafío. 

En relación a la protección por disminución ensignos clínicos (virulencia) En general, se logró observar la disminución en el grado de afectación ante las tres cepas y aunque la vacuna monovalente de BII mostró una reducción total de signos clínicos ante los desafíos de las cepas BII y BIII no alcanzó a reducir el daño al mismo nivel que la vacuna comercial ante desafíos de la cepa BI. 

La vacuna monovalente de BI no es suficiente para reducir el nivel de daño comparada con la Vacuna comercial y la monovalente de BII cuando se realiza el desafío contra la cepa BII (lo que indica que no existe protección cruzada entre estas 2 cepas); por otro lado, los resultados muestran que si puede inferir buena protección contra la cepa BIII.

En relación a la Serología, los grupos no vacunado permanecieron negativos a anticuerpos contra AC durante toda la prueba, como era de esperarse. El análisis de resultados del muestreo serológico posterior a la primera vacunación muestra que 2 semanas no es tiempo suficiente para observar seroconversión contra todas las cepas B y sólo el grupo tratado con la vacuna comercial fue capaz de mostrar respuesta inmune contra las 3 cepas B. El análisis de resultados de los sueros tomados 3 semanas posteriores a la segunda vacunación muestra que el mejor desempeño fue obtenido por los grupos de la vacuna comercial y la Monovalente de BII, los cuales presentan los títulos de anticuerpos más altos contra los tres antígenos. La vacuna Monovalente de BI mostró un buen desempeño contra su cepa homóloga, pero baja inmunogenicidad contra las otras dos cepas. Para el caso de la vacuna monovalente BIII, se observó que alcanzó títulos de anticuerpos a igual nivel que la vacuna comercial, por lo que su presencia en la formulación podría ser de ayuda para tener mayor espectro de protección. Finalmente, el análisis del porcentaje de pollos con títulos de HI mayores a 5 (considerados protectivos) muestra que existe una relación entre éste parámetro y el de protección ante desafío, siendo los grupos con mayor porcentaje de protección los que también presentaron el porcentaje más alto de pollos con títulos de HI mayores a 5.

El hecho de que no exista protección cruzada entre los tres serovares B concuerda con lo reportado por Terzolo y col en 1991 quien menciona que existe poca protección cruzada entre las cepas B. Se puede apreciar la ventaja que confiere tener estas tres cepas B adicionalmente de que en la literatura se menciona que el serotipo B es el que causa más fallas de vacunas contra AC cuando se enfrentan a cepas de B de campo, de tal modo que se ha sugerido incluir en las formulaciones comerciales cepas correspondientes a aislamientos locales para un mejor desempeño. (1) (5) (6).

Adicionalmente se ha reportado que la protección cruzada entre los mismos serovares de B ha sido poco efectiva produciendo sólo una pequeña protección cruzada entre los mismos (1). El objetivo de este estudio fue determinar el porcentaje de protección que confieren las 3 cepas del  Serovar B, contra desafíos cruzados (prueba de protección cruzada), utilizando las cepas presentes en la formulación de una vacuna contra AC que contiene 5 cepas diferentes. 

· El desempeño de la vacuna Comercial fue superior al mostrado de manera independiente por las vacunas monovalentes. Si bien, la monovalente de BII se comportó muy similar a la vacuna comercial, el hecho de contar con dos serotipos B adicionales en la formulación de la comercial le permitió mostrar una tendencia a ser mejor en las cuatro variables analizadas (protección, disminución de signos clínicos, reaislamiento y serología).

· El mejor desempeño observado de las vacunas monovalentes fue mostrado por la vacuna formulada con BII (aislamiento de campo), pero esta no alcanzó a reducir el daño al mismo nivel que la vacuna comercial ante desafíos de la cepa BI.

· En cuanto a la respuesta serología la vacuna monovalente con la cepa de referencia mostro un buen desempeño contra su cepa homologa, pero baja inmunogenicidad contra los aislados de campo. 
 

Referencias
1 Blackall P.J. Vaccines against infectious coryza. World´s Poultry Science Journal 1995, Vol 51: 17-26.
2 Blackall P.J y Soriano V. E. Infectious coryza and related bacterial infections. In: Diseases of Poultry. Blackwell Publishing Professional, Ames 2008, 12; 789-803. 
3 Soriano, E y Terzolo R. H Epizootiologia, prevención y control de la coriza infecciosa. Veterinaria México, 2004, 35 (3): 267-279. 
4 Terzolo, H. R. Revisión sobre Coriza Infecciosa. Propuestas de investigación para su diagnóstico y control. Revista de Medicina Veteterinaria (Bs. As.), 2000, 81 (4): 262-269. 
5 Terzolo, H. R; Sandoval V. E; González Pondal F. Evaluation of inactivated infectious coryza vaccines in chickens challenged by serovar B strains of Haemophilus paragallinarum. Avian Pathology. 1991. 26; 365-376.
6 Waffa A. Abd El- GhanyEvaluation of Autogenous Avibacterium paragallinarum Bacterins in Chickens. International Journal of Poultry Science, 2011, 10 (1): 56-61.