Evaluación de cuatro programas de vacunación desafiadas contra la enfermedad de la bolsa de fabricio bajo condiciones controladas
Publicado: 3 de mayo de 2016
Por: Josue Sanchez, M.V.Z. E.P.A., Asesor técnico negocio avícola Boehringer Ingelheim Vetmedica SA de CV. México
Resumen
Este trabajo se realizó para conocer el comportamiento serológico e histológico de la Bolsa de Fabricio, con vacunas contra la infección de la Bolsa de Fabricio, comparando vacunas con virus vectorizado en herpes virus de pavo por sus siglas en inglés (Turkey herpes virus (HVT)), virus vivo cepa Winterfield y virus vivo modificado cepa intermedia, en aves libres de patógenos específicos por sus siglas en inglés (Specific Pathogen Free (SPF)), de cero a cinco semanas de edad, alojados bajo condiciones controladas en unidades de aislamiento y mismas condiciones de manejo, las cuales fueron separadas en cinco grupos (A, B, C, D y E) donde cada grupo se conformó de veinte aves siendo separadas en cámaras de aislamiento diferentes. Los grupos A, B, C, y D fueron vacunados con los programas de vacunación designados para cada uno y el grupo E fue clasificado como el grupo control negativo desafiado no vacunado, para ser desafiados a los 19 días con una cepa Edgar que induce a la enfermedad de la bolsa de Fabricio. La evaluación de la bolsa de Fabricio, fue realizada de acuerdo con la escala del índice de daño bursal recomendado por la Farmacopea Europea. Por medio de la prueba de ELISA se dio seguimiento a la respuesta serológica generada por la vacunación. La evaluación estadística que se utilizó para definir la diferencia entre grupos para el grado de lesión fue KruskalWallis acompañada de la Prueba de LSMeans (ttest), para evaluar los datos serológicos entre grupos se realizó una prueba de Análisis de Varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey (α=0.05). Los resultados mostraron que los grupos vacunados con la vacuna recombinante y la vacuna liofilizada elaborada con la cepa intermedia, causaron menor grado de lesión que con la vacuna elaborada con complejos inmunes cepa Winterfield, así mismo, se obtuvo mayor presencia de anticuerpos para los grupos vacunados con la cepa intermedia a partir de los 9 días de edad comparativamente con los demás grupos.
Palabras clave: Enfermedad de la bolsa de Fabricio, recombinante, cepa intermedia, cepa Winterfield, severidad de lesiones, ELISA.
Introducción
La infección de la bolsa de Fabricio o enfermedad de Gumboro, es una infección viral, aguda y altamente contagiosa, ocasionada por un virus que pertenece a la familia Birnaviridae . Los virus de esta familia presentan un genoma con dos cadenas de ARN, son sumamente resistentes a los desinfectantes y a las condiciones ambientales adversas; es por esta razón que el virus puede persistir en las casetas durante períodos prolongados. Las células linfoides, especialmente los linfocitos B, son las células blanco primarias y es el tejido linfoide de la bolsa de Fabricio el más severamente afectado. Esto se traduce en una severa inmunosupresión del ave, que la hace susceptible a la infección de agentes secundarios u oportunistas. Las secuelas de la inmunosupresión incluyen dermatitis gangrenosa, hepatitis con cuerpos de inclusión, infecciones por E . c o li y tener una pobre respuesta ante los esquemas de vacunación que se llevan a cabo en las aves. (1). La inmunización de las aves es el principal método que se utiliza para el control de la infección de la bolsa de Fabricio. Se sabe que es importante la inmunización de parvadas reproductoras ya que confiere protección materna a la progenie. El monitorear los niveles de anticuerpos, índice del daño a la bolsa de Fabricio y la protección ante un desafío en la parvada, puede ayudar a determinar el uso de la vacuna adecuada, para impedir que se ponga en riesgo la integridad de la bolsa que pueda comprometer el desempeño de esta antes de la tercer semana de vida del ave. Actualmente existen varias opciones de vacunas a virus vivos y recombinantes disponibles; éstas se basan en su diversidad antigénica y virulencia. De esta manera el principal objetivo de este trabajo es conocer el comportamiento de diferentes vacunas de Gumboro utilizando aves SPF en base a signos clínicos, mortalidad y lesiones en la bolsa después de ser desafiadas contra la enfermedad en la bolsa de Fabricio.
materiales y métodos
En el presente estudio se utilizaron aves SPF de un día de edad sin anticuerpos maternos contra el virus de Gumboro; el estudio se condujo bajo condiciones controladas en unidades de aislamiento, con alimento y abastecimiento de agua acorde con los lineamientos establecidos por a las buenas prácticas clínicas. Se utilizaron tres diferentes vacunas que confieren protección contra el virus de Gumboro de laboratorios comerciales conocidos. Las vacunas fueron reconstituidas y aplicadas de acuerdo a las recomendaciones propias de cada laboratorio de dilución y dosis.
En el presente estudio se incluyeron 5 grupos experimentales con 20 aves cada uno; 4 de estos grupos (A, B, C y D) fueron vacunados con el producto de investigación veterinaria designado y el grupo E como el grupo control negativo no vacunado desafiado; todos los grupos tuvieron un muestreo inicial serológico sin aplicación alguna de vacunas, solo en el grupo E se muestrearon 5 bolsas de Fabricio para su estudio histopatológico antes de la vacunación, como punto comparativo de partida.
Entre cada grupo se utilizaron diluentes nuevos, con equipo de vacunación específico para cada grupo, donde la vacunación fue realizada por un experto en vacunación automatizada.
La vacunación fue realizada con máquinas vacunadoras automáticas, jeringa calibrada a 0.2 ml, vía subcutánea en el tercio medio del cuello a cada una de las aves.
Después de la vacunación, cada grupo fue ingresado a las unidades de aislamiento, en el laboratorio de pruebas en animales, las cuales se mantuvieron bajo presión positiva a 130 pascales con aire filtrado a la entrada y salida, con temperatura controlada. Las cuales utilizan filtros HEPA de 99.997% de efectividad.
Se evaluaron 5 bolsas de Fabricio del grupo E a la edad de 1 día antes de ser vacunados.
A la edad de 19 días antes de ser desafiados, se tomaron muestras de 5 bolsas de Fabricio de los grupos A, B, C y D.
Se colectaron 30 sueros al día 1 de edad antes de la vacunación como muestra basal en aves del mismo lote y 10 sueros de los grupos A, B, C, D y E a los 9,19, 28 y 35 días de edad.
Se desafiaron todos los grupos a la edad de 19 días de edad con cepa Edgar vía ocular a una concentración de 10 E 5.5 DIEP 50/ml a una dosis de 0.03ml. (2)(3) Posteriormente se recolectaron 5 bolsas de Fabricio de cada grupo a los 28 días de edad. Todas las bolsas de Fabricio fueron evaluadas por un experto en histopatología bajo la escala de lesiones descrita en la Farmacopea Europea. (4)
Los signos clínicos, mortandad y lesiones fueron monitoreados, principalmente hasta los 35 días de edad después del desafío.
La respuesta inmune fue monitoreada con dos kits comerciales de ELISA (IBD symbiotics plus utilizado para el grupo A e IDEXX IBD para los grupos B, C, D y E) todos los kits usados en esta prueba, en estudios previos han demostrado su efectividad cuando una vacuna a virus vivo y recombinante es utilizada.
La evaluación de la bolsa de Fabricio, fue evaluada de acuerdo con la escala del índice de daño bursal recomendado por la Farmacopea europea, así mismo, por medio de la prueba de ELISA se dio seguimiento a la respuesta generada por la vacunación. La evaluación estadística que se utilizó para definir la diferencia entre grupos para el grado de lesión fue KruskalWallis acompañada de la Prueba de LSMeans (ttest), para evaluar los datos serológicos entre grupos se realizó una prueba de Análisis de Varianza (ANOVA) y la prueba de Tukey (α=0.05).
Resultados
Se evaluó la presencia de signos clínicos y la mortandad comparada entre grupos antes y posterior al desafío.
No se observó signología clínica sugestiva a la enfermedad de la bolsa de Fabricio en los grupos A, B, C y D antes y después del desafío.
El grupo E, después del desafío presentó un cuadro de depresión.
Mortandad
No se presentó mortandad en los grupos A, B, C y D antes ni después del desafío.
El grupo E, presentó 1 animal muerto después del desafío.
Sólo el grupo B y E después del desafío, mostraron en el total de sus bolsas edema.
Lesiones microscópicas antes del desafío.
Los grupos A, C y D no mostraron cambios en la bolsa significativos en la escala de la Farmacopea Europea a la edad de 19 días antes del desafío. De igual manera para el grupo E al día de edad.
El grupo B, obtuvo una calificación de 1 en la escala de la Farmacopea Europea a la edad de 19 días antes del desafío, donde se observó que del 1 al 25 % de los folículos presenta un agotamiento linfocitario (es decir, menos del 50 % de agotamiento en el folículo afectado) y afluencia de células heterofilias en las lesiones.
El grupo A, C y D a los 19 días de edad antes del desafío y el grupo E al día de edad antes de la vacunación, obtuvieron bolsas con calificación dentro de la escala de cero la cual indica ausencia de lesiones.
El grupo B a los 19 días de edad antes del desafío obtuvo una calificación dentro de la escala de 1 la cual indica que del 1 al 25 % de los folículos presenta un agotamiento linfocitario y afluencia de células heterófilas en las lesiones.
El grupo B a los 28 días de edad, obtuvo bolsas con calificación en su mayoría dentro de la escala 4 y un promedio de 3.7, las cuales indican que del 76 al 100 % de los folículos presentan un agotamiento linfocitario casi total, se detecta hiperplasia y estructuras quísticas; los folículos afectados presentan necrosis y una importante afluencia de células heterofilias.
El grupo E a los 28 días de edad, obtuvo bolsas con calificación dentro de la escala de 3, 4 y 5, obteniendo un promedio de 4.1. Las lesiones van desde:
Escala 3. Del 51 al 75 % de los folículos presentan un agotamiento linfocitario casi total; los folículos afectados presentan necrosis y se detecta una importante afluencia de células heterofilias.
Escala promedio 4 para el grupo E. Del 76 al 100 % de los folículos presentan un agotamiento linfocitario casi total, donde se detecta hiperplasia y estructuras quísticas; los folículos afectados presentan necrosis y una importante afluencia de células heterofilias.
Escala 5. El 100 % de los folículos presentan un agotamiento linfocitario casi total; pérdida completa de la estructura folicular, epitelio espeso y plegado, fibrosis del tejido de la bolsa de Fabricio.
Los grupos A, C y D a los 28 días de edad obtuvieron bolsas con calificación dentro de la escala de cero la cual indica ausencia de lesiones.
Comparación entre grupos para datos de Lesión
Para evaluar si los Grupos: A, B, C, D y E son semejantes o diferentes en cuanto a grado de lesión se realizó la prueba de Kruskal-Wallis acompañada de la Prueba de LSMeans (t-test) que realiza la comparación entre grupos involucrados en el análisis.
Con el criterio de lesión, se puede observar que al comparar los grupos; son diferentes de acuerdo a la prueba de Kruskal-Wallis y al aplicar una prueba de separación de medias LSMEANS (prueba de t), esta muestra que el Grupo B (a) y el Grupo E (a) presentaron las lesiones mayores en comparación con el Grupo A (b) y Grupo C (b). (Figura 1).
Serología ELISA IBD por fechas.
Con los valores de serología de ELISA IBD se realizó
e l a n á li s i s d e v a r i a n z a q u e m o s t r ó d i f e r e n c i a significativa entre grupos y de acuerdo a la prueba de Tukey ( α =0.05) se pudo visualizar que a los 9 y 19 días los Grupos C, D (a) mostraron valores mayores a los Grupos A y B. Manteniendo la misma tendencia a los 28 y 35 días los mismos grupos C, D mostraron los mayores valores en comparación con A y B (Figura 2).
e l a n á li s i s d e v a r i a n z a q u e m o s t r ó d i f e r e n c i a significativa entre grupos y de acuerdo a la prueba de Tukey ( α =0.05) se pudo visualizar que a los 9 y 19 días los Grupos C, D (a) mostraron valores mayores a los Grupos A y B. Manteniendo la misma tendencia a los 28 y 35 días los mismos grupos C, D mostraron los mayores valores en comparación con A y B (Figura 2).
¿Existen diferencias significativas a la mortandad comparada entre grupos posteriormente al desafío?
El grupo control negativo no vacunado desafiado presento un ave muerta post desafío. Al ser sometidos al análisis estadístico clasifica a los grupos como no diferentes estadísticamente en su porcentaje de mortandad.
El Dr.Saif, refiere que la bolsa de Fabricio al ser desafiada puede presentar lesiones como edema, hemorragias petequiales, exudado caseoso, entre otras, en el caso del grupo B y E estuvieron presentes en la totalidad de las bolsas.
Todos los grupos vacunados demostraron proteger contra mortalidad.
Evaluación de la bolsa de Fabricio, de acuerdo con la escala del índice de daño bursal bajo la Farmacopea europea.
Los grupos vacunados con las vacunas HVT IBD vectorizada e IBD MLV cepa intermedia no causan cambios significativos en la bolsa de
Fabricio, no siendo así, para el grupo vacunado con cepa Winterfield y el grupo testigo los cuales presentaron los mayores cambios en la bolsa post desafío llegando a grados promedio de 3.7 para el grupo vacunado con cepa Winterfield y 4.1 para el grupo control negativo no vacunado desafiado.
Fabricio, no siendo así, para el grupo vacunado con cepa Winterfield y el grupo testigo los cuales presentaron los mayores cambios en la bolsa post desafío llegando a grados promedio de 3.7 para el grupo vacunado con cepa Winterfield y 4.1 para el grupo control negativo no vacunado desafiado.
Basados en la escala para el registro de lesiones microscópicas de la bolsa de Fabricio de acuerdo a la Farmacopea Europea, los cambios en la bolsa localizadas en el grado 3, indican que del 51 al 75 % de los folículos presentan un agotamiento linfocitario casi total, rrespectivamente para el grado 4 donde observamos que del 76 al 100 % de los folículos presentaron agotamiento linfocitario casi total.
Seguimiento serológico para todos los grupos contra IBD.
El análisis de varianza, mostró diferencia significativa entre grupos y de acuerdo a la prueba de Tukey (α=0.05) se pudo visualizar que a los 9 y 19 días los Grupos C, D mostraron valores mayores a los Grupos A y B.
Manteniendo la misma tendencia a los 28 y 35 días.
Basados en los estudios estadísticos podemos concluir que los grupos vacunados con la vacuna elaborada con la cepa intermedia a una y dos aplicaciones, da una respuesta serológica mayor y en menor tiempo que los grupos vacunados con las vacunas HVT IBD recombinante y cepa Winterfield.
Referencias
1. Eterradossi, N., Saif, Y.M. Infectious bursal disease. In Y. M. Saif, A. M. Fadly, J.R.Glisson, L. R. McDougald, L. K. Nolan, D. E.Swayne (Eds.), Diseases of Poultry. 12 nd. Blackwell Publishing, 2008: 185208.2. OIE Terrestrial Manual. 2008. Infectious Bursal Disease (Gumboro Disease). Chapter 2.3.12. pp. 550-565.
3. USDA. June 25, 2008. Veterinary services Memorandum 800.201
4. European Pharmacopoeia version 6.6.6th edition 2010.
5. Jackwood DJ, Sommer SE, Odor E. Correlation of enzyme-linked immunosorbent assay titers with protection against infectious bursal disease virus. Avian Dis. 1999 Apr-Jun; 43(2):189-97.
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