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Elisa y HI como indicadores de protección vacunal o diagnóstico de la Enfermedad de Newcastle

Publicado: 20 de abril de 2016
Por: Eliana Icochea, Gonzalez R, Cribillero G, Ofelia Alzamora Pinao. Facultad de Medicina Veterinaria, Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima –Perú.
RESUMEN
El objetivo del presente estudio  fue evaluar los títulos de anticuerpos obtenidos mediante las pruebas de ELISA e inhibición de la hemaglutinación (HI),  como indicadores de protección vacunal o como herramienta de diagnóstico de la Enfermedad de Newcastle (ENC) en pollos vacunados con dos programas vacunales y  desafiados  o no con un virus patógeno de la ENC. Un total de 90 pollos de 1 día de edad fueron distribuidos  en 3 grupos de 30 aves cada uno.  

El grupo A  hiperinmunizado con dos vacunas inactivadas oleosas (1 y 10 días de edad) y tres vacunas vivas cepa La Sota (1, 10 y 17 días de edad); el grupo B vacunado con un programa suave contra ENC que incluyó una vacuna inactivada oleosa (1  día de edad) y dos vacunas vivas  una cepa B1 y una cepa La Sota (1 y 10 días de edad); el grupo C fue el control no vacunado. El desafío se realizó vía ocular a los 25 días de edad,  con un virus velogénico viscerotrópico  de la ENC, genotipo XII (IPIC 1.92),  dosis 30 µL, y título  106 DIE50.  Para la evaluación de aves sin desafío fueron colectadas 60 muestras de sangre de aves criadas en campo, 30 vacunadas con el programa A y  30 vacunadas con el programa B.  La respuesta de anticuerpos fue evaluada antes del desafío a los 25 días de edad como indicador de protección vacunal y post desafío a los 42 días como herramienta de diagnóstico.  Los resultados fueron organizados en base al título obtenido para cada prueba. Para HI se consideraron los siguientes rangos: Negativo (0) positivo bajo (2 a 16), positivo medio (32 a 64) y positivo alto (128 a mas). Para ELISA: Negativo (0 a 399), positivo bajo (400 a 2999), positivo medio (3000 a 4999) y positivo alto (5000 a mas). Previo al desafío a los 25 días de edad,   las aves del grupo A por HI fueron: Negativas (25) positivas bajo (5), positivo medio (0) y positivo alto (0). Mientras que por la prueba de ELISA: Negativo (12) positivo bajo (15), positivo medio (2) y positivo alto (1).  

Las aves del grupo B por HI fueron: Negativas (30) positivas bajo (0), positivo medio (0) y positivo alto (0). Mientras que por la prueba de ELISA: Negativo (27) positivo bajo (3), positivo medio (0) y positivo alto (0).  Posterior al reto, a los 42 días de edad,   las aves del grupo A por HI fueron: Negativas (3) positivas bajo (21), positivo medio (2) y positivo alto (0). Mientras que por la prueba de ELISA: Negativo (0) positivo bajo (2), positivo medio (1) y positivo alto (23).  Las aves del grupo B por HI fueron: Negativas (0) positivas bajo (15), positivo medio (1) y positivo alto (0). Mientras que por la prueba de ELISA: Negativo (0) positivo bajo (0), positivo medio (1) y positivo alto (15). Respecto a las aves no desafiadas a los 42 días de edad, las aves del grupo A por HI fueron: Negativas (5), positivas bajo (13), positivo medio (0) y positivo alto (0). Mientras que por la prueba de ELISA: Negativo (5), positivo bajo (11), positivo medio (2) y positivo alto (0).

En el grupo B  por HI fueron: Negativas (18), positivas bajo (12), positivo medio (0) y positivo alto (0). Mientras que por la prueba de ELISA: Negativo (21), positivo bajo (9), positivo medio (0) y positivo alto (0). La sensibilidad de la prueba de ELISA fue mayor (98%) que la de HI (93%), contrariamente la especificidad de la prueba de HI fue mayor (100%) que la de ELISA (97%). El índice de correlación de kappa de ambas pruebas obtenido a los 25 y 42 días de edad, tanto en aves desafiadas como no desafiadas fue igual a 0,   indicando muy pobre correlación entre ambas pruebas. Los resultados de este estudio mostraron que la prueba de ELISA fue mejor indicador de protección vacunal a los 25 días de edad en aves hiperinmunizadas y mejor herramienta de diagnóstico a los 42 días en aves desafiadas que la prueba de HI. 
Palabras claves: ELISA, Inhibición de la Hemaglutinación (HI), Enfermedad de Newcastle.
 
 
I. ANTECEDENTES 
La enfermedad de Newcastle (ENC) es causada por un paramixovirus tipo I. Esta enfermedad afecta a todas las aves de producción y traspatio. Asimismo, en las aves infectadas se observan variables signos clínicos: respiratorios, nerviosos, depresión y muy alta mortalidad [1]. Por esta razón, la enfermedad tiene un impacto económico negativo sobre la producción aviar. La bioseguridad y la vacunación son las principales herramientas de prevención de la enfermedad[2].  Las vacunas disponibles incluyen combinaciones de vacunas vivas, inactivadas o vacunas vectorizadas[3].  El monitoreo de programa vacunal o la aproximación a un diagnóstico se realiza mediante pruebas serológicas, siendo  las más usadas inhibición de la hemaglutinación (HI) y ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)[4].  Un estudio anterior realizado en aves vacunadas no desafiadas [5] encontró  una alta concordancia entre ambas pruebas HI y ELISA, sin embargo en un estudio reciente realizado en aves vacunadas y desafiadas se encontró muy pobre concordancia entre ambas pruebas[6]. 
 
II. MATERIALES Y METODOS 
2.1 Lugar y tiempo de estudio 
El estudio se realizó entre los meses de noviembre y diciembre del 2015, usando las facilidades de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima- Perú, en las unidades de experimentación y en el Laboratorio de Patología Aviar.
 
2.2 Animales
Se criaron 90 pollos BB de 1 día de edad de la línea Cobb Vantress, provenientes de un mismo lote de reproductoras, los cuales fueron distribuidos en tres grupos de 30 aves cada uno. Todas las aves fueron identificadas individualmente con un anillo metálico en el tarso. 
 
2.6 Diseño Experimental 
El estudio comprendió tres grupos de aves: Grupo A hiperinmunizado contra ENC con dos vacunas inactivadas oleosas y tres vacunas vivas con cepa La Sota. Grupo B: vacunado con un programa suave contra la ENC que incluyó una sola vacuna inactivada oleosa y dos vacunas vivas, una con cepa B1 y una cepa La Sota; Grupo C: Control no vacunado. Las vacunas vivas fueron aplicadas por vía gota ocular y las vacunas inactivadas por vía subcutánea. Las aves de los tres grupos fueron desafiadas con un virus velogénico viscerotrópico de la ENC a los 25 días de edad. Adicionalmente,  a los 42 días de edad fueron evaluadas aves del mismo lote no desafiadas y criadas en campo, 30 vacunadas con el programa A y 30 con el programa B. Las aves del grupo control fueron mantenidas en estricto aislamiento hasta su desafío a los 25 días de edad. El cuadro 1 muestra la distribución de aves y el programa de vacunación.   
Elisa y HI como indicadores de protección vacunal o diagnóstico de la Enfermedad de Newcastle - Image 1
2.7 Características del inóculo y desafío 
Para el desafío se usó un inóculo conteniendo una cepa velogénica viscerotrópica del virus de la ENC, genotipo XII con un IPIC 1.92. Las aves fueron desafiadas a los 25 días de edad vía ocular con una dosis de 30 µL del virus con un título de 106 DIE50.
 
2.8 Parámetros de evaluación 
a) Respuesta serológica .
La respuesta de anticuerpos fue evaluada antes del desafío a los 25 días de edad y a los 42 días de edad, los anticuerpos fueron medidos por las pruebas de inhibición de la hemaglutinación (HI) y Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Para la prueba de HI se siguió el protocolo del manual de la OIE [1]  usando un antígeno de Laboratorios Charles River® conteniendo 8 unidades hemaglutinantes.  Para la prueba de ELISA se utilizó un kit de los laboratorios IDEXX® siguiendo las indicaciones del fabricante.
El uso de las pruebas como indicador de protección vacunal  comprendió la evaluación del nivel de anticuerpos de cada ave del grupo experimental en relación a su estado clínico o mortalidad después del desafío.  Como herramienta de diagnóstico se compararon los títulos de anticuerpos obtenidos a los 42 días de edad en las aves experimentales desafiadas y las de campo no desafiadas. Los resultados fueron organizados en base al título obtenido para cada prueba. Para HI se consideraron los siguientes rangos: Negativo (0) positivo bajo (2 a 16), positivo medio (32 a 64) y positivo alto (128 a mas). Para ELISA: Negativo (0 a 399), positivo bajo (400 a 2999), positivo medio (3000 a 4999) y positivo alto (5000 a mas).
 
2.9 Análisis estadístico
a) Análisis de concordancia:
 Las muestras fueron analizadas en forma pareada para  HI y ELISA, determinándose  la correlación estadística entre ambas pruebas. Para el análisis de los resultados de serología se utilizó el índice de kappa de Cohen (κ) con el fin de determinar si hubo concurrencia entre la prueba de inhibición de la hemaglutinación (HI) y la prueba de ELISA en los programas vacunales contra la ENC.
b) Determinación de sensibilidad y especificidad:
- Como positivos se consideraron a los sueros colectados a los 42 días de edad procedentes de los grupos que fueron desafiados.
- Como negativos se consideraron a los sueros colectados a los 25 días de edad procedentes del grupo control no vacunado y no desafiado.
 
III. RESULTADOS 
Los resultados de la evaluación serológica previo al reto a los 25 días de edad (cuadro 2) fueron: En el Grupo A, por la prueba de ELISA  no se detectaron anticuerpos  en el 40%  de los sueros mientras que por HI el 83 % fueron negativos. De otro lado se detectaron anticuerpos con título positivo bajo, en el Grupo A: por ELISA (50%)  y por HI (17%). Solo por ELISA se detectaron títulos positivos medianos (6%).  En ningún caso se detectaron títulos positivos altos. En el grupo B y Control los títulos de anticuerpos detectados por la prueba de ELISA a los 25 días de edad fueron negativos en un 90% y 97% respectivamente,  mientras que  por la prueba de HI el 100% de los sueros de ambos grupos fueron negativos. En el grupo B y control se detectaron en el rango positivo bajo 10% y 3% de las muestras respectivamente. Los títulos de anticuerpos por ELISA antes del reto fueron diferentes en el grupo A respecto a los grupos  B y control, siendo los valores de títulos contra ENC más altos el grupo A (Figura 1). Mientras que en la prueba de HI no se observaron diferencias entre grupos en títulos de anticuerpos antes del reto (datos no mostrados).  El índice de correlación de kappa obtenido en los grupos antes del desafío a los 25 días fue igual a 0,  lo que indica muy pobre correlación entre ambas pruebas. 
Los resultados de la evaluación serológica post desafío a los 42 días de edad, en los  grupos vacunados y desafiados (A y B) y control desafiado (cuadro 2), detectaron por la prueba de ELISA títulos de anticuerpos en el rango de positivo alto: en el grupo B (94%), Grupo control (100%) y  grupo A (88%).  Mientras que la prueba de HI detectó anticuerpos en el rango positivo bajo en un 81%,  94% y 75%  para los grupos A, B y control respectivamente.
Respecto a la evaluación serológica a los 42 días de edad en los grupos de aves vacunadas no desafiadas, mediante la prueba de ELISA se obtuvieron para los grupos A y B : 28% y 70% de muestras negativas; y 61% y 30% de muestras en el rango positivo bajo respectivamente. En el grupo A vacunado no desafiado sólo el 11% de muestras fue detectado en el rango positivo medio y en el grupo B ninguna. Por otro lado los resultados de la prueba de HI para los grupos A y B de campo no desafiados,   detectaron 28% y 60% de muestras negativas respectivamente. Asimismo, la prueba de HI  detectó en el grupo A 72% de muestras con rango positivo bajo y en el grupo B 40% en el mismo rango.  El índice de correlación de kappa de ambas pruebas obtenido a los 42 días de edad, tanto en aves desafiadas como no desafiadas fue igual a 0,   indicando muy pobre correlación entre ambas pruebas. 
La sensibilidad de la prueba de ELISA fue de 98% y la especificidad de 97% y para la prueba de HI la sensibilidad fue de 93% y la especificidad de 100%.  Posterior al reto a los 42 días de edad no se observaron diferencias entre los títulos de ELISA entre grupos desafiados, sin embargo si se observaron diferencias por esta prueba entre los grupos desafiados y no desafiados,   siendo los valores de títulos contra ENC  considerablemente más altos en los grupos desafiados que en los no desafiados (Figura 2).  Asimismo, la prueba de HI  detectó diferencias entre los títulos de anticuerpos a los 42 días de edad entre los grupos desafiados y no desafiados, a pesar de no distinguir muestras con títulos altos. El análisis de regresión lineal de los valores de ELISA y HI no fue significativo, por lo que un valor de HI no puede predecir un valor en ELISA ni viceversa. Los títulos de anticuerpos son directamente proporcionales para ELISA y HI, siendo más parecidos cuando los títulos son altos (Figura 3).
Elisa y HI como indicadores de protección vacunal o diagnóstico de la Enfermedad de Newcastle - Image 2
Elisa y HI como indicadores de protección vacunal o diagnóstico de la Enfermedad de Newcastle - Image 3
Elisa y HI como indicadores de protección vacunal o diagnóstico de la Enfermedad de Newcastle - Image 4
Elisa y HI como indicadores de protección vacunal o diagnóstico de la Enfermedad de Newcastle - Image 5
 
IV. DISCUSION 
El presente estudio  evaluó los títulos de anticuerpos obtenidos mediante las pruebas de ELISA e inhibición de la hemaglutinación (HI) como indicadores de protección vacunal o como herramienta de diagnóstico de la ENC. Con este fin se usaron pollos hiperinmunizados y pollos vacunados con un programa suave, desafiados  o no con un virus patógeno de la ENC. Antes del reto a los 25 días de edad, mediante la prueba de HI se detectaron solo valores mínimos de anticuerpos en las aves hiperinmunizadas y no se detectaron anticuerpos en las aves con el programa suave. Solo con la prueba de ELISA se detectaron títulos de anticuerpos más altos antes del reto en el grupo hiperinmunizado  respecto al grupo con el programa suave.  Estos resultados indican que la prueba de HI como indicador de protección vacunal presentó una sensibilidad de grado bajo porque detectó anticuerpos pero solo en el rango de positivo bajo, no siendo capaz de detectar anticuerpos en un rango positivo mediano o alto en comparación con la prueba de ELISA. 
La detección de anticuerpos como herramienta de diagnóstico a los 42 días de edad,  en aves desafiadas con un virus velo génico de ENC, mostró que la prueba de ELISA fue más sensible en detectar la mayor cantidad de muestras en el rango positivo alto. En contraste la prueba de HI detectó  anticuerpos solo en el rango positivo bajo.   En nuestro estudio no se obtuvieron diferencias a los 42 días de edad entre los títulos de HI obtenidos en los grupos desafiados y los  grupos no desafiados vacunados con un programa de intensivo.
La sensibilidad y especificidad de las pruebas determinada con los sueros colectados a los 17  días post desafío (verdaderamente positivas) y con los sueros colectados a los 25 días de edad de las aves control no desafiado (verdaderamente negativas), mostró mayor sensibilidad de la prueba de ELISA (98%) que la prueba de HI (93%), sin embargo la prueba de HI  mostró mayor especificidad (100%) que la prueba de ELISA (97%).  Esto explica el resultado obtenido en el grupo control de nuestro estudio donde se detectaron 3% de muestras seropositivas con títulos en el rango positivo bajo. 
Pocos estudios han analizado la concordancia entre las pruebas de HI y ELISA en aves desafiadas bajo condiciones experimentales o de campo. Un estudio realizado en el año 1990 en aves vacunadas no desafiadas obtuvo similares resultados de sensibilidad (98.2%) pero no de especificidad (91.7%) para ELISA con respecto a HI; sin embargo a diferencia de nuestro estudio la prueba de Kappa determinó una alta concordancia entre ambas pruebas (5).  De otro lado, resultados similares se obtuvieron en un reciente estudio realizado en aves vacunadas y desafiadas, obteniéndose una concordancia pobre en la detección de anticuerpos entre las pruebas de HI y ELISA (6). 
Los resultados del estudio permiten concluir que a los 25 días de edad y sin desafío la prueba de ELISA fue más sensible en detectar anticuerpos vacunales en el suero de aves vacunadas con un programa intensivo (3 vacunas vivas y 2 vacunas inactivadas), demostrando ser un mejor indicador de protección vacunal que la prueba de HI.  Además  indicaron que la prueba de ELISA es una eficaz herramienta de diagnóstico indirecto  de la Enfermedad de Newcastle y por el contrario la prueba de HI a la edad de saca podría conducir a un diagnóstico serológico erróneo de la ENC en pollos de engorde vacunados con un programa intensivo como el del grupo A de campo del estudio.
 
 
BIBLIOGRAFIA
[1] OIE, “Manual de las Pruebas de Diagnóstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres 2015,” Manual de las Pruebas de Diagnóstico y de las Vacunas para los Animales Terrestres 2015 , 2015. [Online]. Available: http://www.oie.int/es/normasinternacionales/manual-terrestre/accesoen-linea/. [Accessed: 02-Mar-2016].
[2] N. Hines and C. Miller, “Avian Paramyxovirus Serotype-1: A Review of Disease Distribution, Clinical Symptoms, and Laboratory Diagnostics,” V e t . M e d . Int. , vol. 2012, p. 17, 2012.
[3] P. Miller and G. Koch, “Newcastle Disease,” in Diseases of Poultry , 13th ed., D. Swayne, J. Glisson, L. Mc Dougald, L. Nolan, D. Suarez, and V. Nair, Eds. Iowa, USA: Willey-Blackwell Publishing, 2012, pp. 89–107.
[4] D. Alexander and D. Senne, “Newcastle Disease, Other Avian Paramyxoviruses and Pneumovirus Infections,” in L a b o r a t o r y M a n u a l f o r t h e I s o l a t i o n , I d e n t i f i c a t i o n a n d C h a r a c t e r i z a t i o n o f A v i a n P a t h o g e n s , 4th ed., L. Dufourzavala, D. Swayne, J. Glisson, M. Jackwood, J. Pearson, W. Reed, and P. Woolcock, Eds. Athens GA: American Association of Avian Pathologists, 2008, pp. 135–141.
[5] J. Brown, R. S. Resurreccion, and T. G. Dickson, “The Relationship between the Hemagglutination-Inhibition Test and the Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for the Detection of Antibody to Newcastle Disease,” A v i a n D i s . , vol. 34, no. 3, pp. 585–587, 1990.
[6] C. Cajacuri, “Concordancia entre las pruebas de Inhibición de la Hemoaglutinación y ELISA en la detección de anticuerpos contra el virus de la Enfermedad de Newcastle,” UNMSM, 2014.
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Autores:
Eliana Icochea
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