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Efecto de un tratamiento con Bromesol y Avlosin sobre el número de macrófagos presentes en el pulmón de pollos parrilleros sanos

Publicado: 2 de junio de 2015
Por: Dr. Raúl Cerdá; Dr. Claudio Barbeito; y Dr. Enrique Leo Portiansky.
INTRODUCCION
El aparato respiratorio de las aves es probablemente el más complejo del reino animal. Esto obedece en buena medida a las elevadas necesidades metabólicas requeridas para el vuelo. Los componentes del aparato respiratorio aviar son los siguientes:
  • Cavidad nasal (semejante a la de los mamíferos).
  • Laringe anterior (poco desarrollada).
  • Traquea (posee ligeras diferencias respecto al mismo órgano de los mamíferos).
  • Siringe o laringe posterior (órgano de fonación propio de las aves).
  • Bronquios extrapulmonares.
  • Pulmón.
  • Sacos aéreos (estructuras extrapulmonares conectadas con los bronquios que actúan como reservorios de aire).
Los pulmones de las aves difieren sustancialmente del órgano homólogo de los mamíferos. No podemos hablar de un árbol bronquial aviar sino que la porción conductora de aire toma una disposición laberíntica.
En la gallina, los pulmones son dos órganos esponjosos ubicados en la región cráneo –dorsal de la cavidad torácica. Su aspecto esponjoso y su tamaño relativo es menor al del mismo órgano en los mamíferos.
Una membrana serosa, la pleura, recubre los pulmones y envía a su interior proyecciones de tejido conjuntivo que constituyen el estroma del órgano. El parénquima pulmonar está constituido por: bronquios primarios o mesobronquios, bronquios secundarios, bronquios terciarios o parabronquios, atrios, infundíbulos y capilares aéreos.
Los mesobronquios son la continuación de los bronquios extrapulmonares, poseen placas de cartílago y un epitelio pseudoestratificado ciliado con glándulas intraepiteliales. Estos mesobronquios penetran en el hilio del órgano y lo recorren en S hasta alcanzar el borde caudo-lateral terminado en el saco aéreo abdominal. En su trayecto cada mesobronquio emite tres grupos de bronquios secundarios.
Los bronquios secundarios poseen un epitelio cilíndrico ciliado, con escasas glándulas intraepiteliales y numerosas células caliciformes aisladas. No poseen cartílago pero su capa muscular es proporcionalmente mayor a la equivalente de los bronquios primarios. En su trayecto, los bronquios secundarios emiten los bronquios terciarios o parabronquios que forman una red de túbulos anastomosados, que se comunican con los sacos aéreos.
Los parabronquios poseen una luz de 100-150 µm. Su pared está constituida por un epitelio plano o cúbico, por debajo del mismo existe una delgada capa conjuntiva a la que sigue una capa de músculo liso de 3-5 células de espesor.
Durante su recorrido, esos parabronquios dan origen a los atrios. Los atrios, de forma más o menos redondeada, poseen un epitelio cúbico con núcleo redondo y oval y carecen de músculo. Los atrios se adelgazan para formar los infundíbulos de los que se originan los capilares aéreos. Todo el parénquima pulmonar se rodea de una capa muy delgada de tejido conjuntivo y posee un contorno hexagonal.
Los capilares aéreos son el sitio en donde ocurre la hematosis, proceso por el cual se produce el intercambio gaseoso entre el medio interno y externo. Miden 5-15 µm de diámetro, por lo que su luz es mucho más pequeña que la correspondiente a los alvéolos pulmonares de los mamíferos. También se diferencian de éstos por poseer un solo tipo celular en su pared. Estas células son planas y corresponden al neumocito tipo I de los mamíferos. El neumocito tipo II no existe en las aves y su función de producir la sustancia surfactante es realizada por las células de los parabronquios y atrios. El epitelio de los capilares aéreos se apoya sobre una lámina basal y su único componente conjuntivo es una red de fibras reticulares que rodea la misma. El intersticio entre los capilares aéreos y entre éstos y los capilares sanguíneos está constituido por fibras reticulares y macrófagos. Los macrófagos también se encuentran en la luz de los capilares y suelen denominarse células alveolares.
Los macrófagos intersticiales poseen formas variadas, con un diámetro de aproximadamente 5 micrómetros. Cuando están libres son redondeados o poligonales y llegan a alcanzar los 10 micrómetros. Su citoplasma puede poseer o no un aspecto vacuolado. Su núcleo es redondo o arriñonado, relativamente grande y por lo general de posición central.
Actualmente se sabe que los macrófagos tienen variadas funciones en los procesos inflamatorios. Además de poseer capacidad fagocítica, estas células actúan como presentadores de antígenos y secretan gran cantidad de sustancias, algunas de las cuales regulan la función de otras células y otras, como la interleuquina 1 y el factor de mecrosis tumoral, poseen múltiples acciones locales y generales.
La actividad inmunomoduladora de los antibióticos macrólidos ha sido estudiada por varios investigadores. Esta clase de antibióticos modulan las funciones de las células inflamatorias tales como leucocitos polimorfonucleares, linfocitos y macrófagos. Por otra parte, afectan directamente las funciones de las células secretorias de las vías aéreas y las células epiteliales. Estos efectos podrían explicar la eficacia de los macrólidos en el tratamiento de las afecciones respiratorias.
Otra droga muy utilizada tanto en medicina humana como veterinaria por su eficacia en el tratamiento de infecciones del sistema respiratorio es la bromexina. A sus propiedades de agente mucolítico o fluidificador del mucus de las vías aéreas, se le suman también su actividad como estimulador del sistema inmunológico.
 
OBJETIVOS
Teniendo en cuenta que las enfermedades respiratorias son las principales causas de pérdidas económicas en la producción avícola, nos propusimos como objetivos de este trabajo evaluar la actividad inmunomoduladora de un complejo mucolitico (Bromesol® Vetanco S.A.) y del 3-acetil, 4"isovaleril tartrato de tilosina (Aivlosin ® Vetanco S.A.), nuevo macrólido obtenido por biofermentación de la tilosina.
 
MATERIALES Y METODOS
Diseño experimental
Para el desarrollo de esta prueba se emplearon 40 pollos parrilleros de 20 días de vida libres de Salmonella y Mycoplasma, con los que se formaron 4 grupos para los distintos tratamientos. Los animales del grupo 1 fueron considerados como control ya que no recibieron ningún tipo de tratamiento. Los del grupo 2 recibieron Aivlosin (0.25 g/2 litros de agua) mientras que a los del grupo 3 se les administró Bromesol® (2-Amino-3,5- Dibromobencil Amina) (Bromesol® Vetanco S.A.) a las dosis indicadas por el fabricante (1lt cada 1000 litros de agua de bebida, 10 mg de droga pura x lito de agua). Los animales del grupo 4 recibieron una combinación de Bromexina y Aivlosin. A los 5 días postratamiento, todos los animales fueron sacrificados. Se extrajeron los pulmones de los pollos de cada lote, los que posteriormente se fijaron en formol al 10%. Los mismos fueron: a) deshidratados en una batería de alcoholes de concentración creciente; b) aclarados en xilol y c) incluidos en parafina.
Los tacos obtenidos fueron cortados con un micrótomo de deslizamiento obteniéndose secciones de 5µm de espesor.
De cada órgano se montaron tres cortes, para realizar las siguientes técnicas: a) Hematoxilina y Eosina; b) Giemsa y c) Inmunocitolocalización (inmunohistoquímica) del Antígeno Mac1.
Hematoxilina y eosina
Es la técnica de rutina en histología. La combinación de un colorante ácido y otro básico permite reconocer la estructura general del órgano y nos otorga una primera aproximación a su citología.
Técnica:
  • Desparafinado de los cortes en xilol, utilizando dos pasajes de no menos de 5 minutos cada uno.
  • Hidratación en una serie de alcoholes de concentración decreciente (100, 96, 80, 70) y posteriormente en agua destilada. El corte se coloca durante 2 minutos en cada cubeta.
  • Coloración con hematoxilina durante 1 minuto.
  • Viraje de la hematoxilina en agua corriente, hasta ver un color azul violáceo en los cortes.
  • Lavado con agua destilada. • Coloración con eosina durante 30 segundos.
  • Deshidratación, sumergiendo fugazmente los cortes en una batería de alcoholes de concentración creciente (70, 96, 100). Utilizando dos soluciones de cada concentración.
  • Tratamiento con xilol, utilizando al menos dos baños de 3 minutos cada uno.
  • Montaje con Bálsamo de Canada.
Resultado: se observan los núcleos celulares azul violáceo y la mayor parte del citoplasma rosa. En el caso de los macrófagos este citoplasma puede tener un aspecto espumoso.
Coloración de Giemsa (según procedimiento de Gaffney)
Esta técnica, si bien no es específica para macrófagos, permite observar detalles nucleares (importantes para diferenciar a estas células de los glóbulos rojos nucleados de las aves). El citoplasma de los macrófagos también adquiere una coloración rosa manifiesta, mientras que los ertitrocitos son de color rojo. Por último, el Giemsa nos facilita la discriminación de células cebadas cuyos gránulos metacromáticos se visualizan muy bien con esta técnica.
Técnica:
  • Preparación la solución matriz que consiste en una combinación de: a) solución azur IIeosina y b) solución colorante de May-Grünwald.
  • Dilución (debe realizarse en el día) colocando una parte de la solución matriz en 5 de solución acético acuosa. Se obtiene así la solución diaria de Giemsa.
  • Desparafinado e hidratación idénticas a las desarrolladas en la técnica de la Hematoxilina y Eosina.
  • Coloración en la solución diaria de Giemsa durante una hora.
  • Observación al microscopio para comprobar la calidad de la coloración.
  • Deshidratación con alcohol absoluto (tres pasajes rápidos).
  • Aclaración con xilol (tres baños de no menos de 2 minutos).
  • Montaje con Balsamo de Canada.
Resultado: Se observan los citoplasmas rosas, los núcleos azules, las bacterias y algunos parásitos azules, el citoplasma de los eritrocitos rojo y los gránulos de las células cebadas púrpura.
Inmunohistoquímica (para localización específica del antígeno Mac-1)
La inmunohistoquímica permite la localización específica de sustancias antigénicas en el organismo.
En el presente trabajo la sustancia a localizar fue el marcador de superficie Mac-1, específico de macrófagos y granulocitos. Las diferencias morfológicas entre macrófagos y granulocitos permite distinguirlos con seguridad, pese a que ambas poblaciones celulares se marquen con el mismo anticuerpo. La pérdida de antígenos por la formación de puentes con el formol es uno de los inconvenientes más grandes para la inmunohistoquímica, para solucionarlo se han desarrollado métodos físicos y químicos de recuperación antigénica. En el presente trabajo se utiliza el método del ultrasonido.
Técnica:
  • Montado de los cortes en vidrios tratados con silane.
  • Desparafinado e hidratación de los cortes.
  • Inactivación de la peroxidasa endógena.
  • Lavado con PBS.
  • Recuperación antigénica mediante la técnica del ultrasonido. Colocando los vidrios en una cubeta con buffer de citrato pH 6. Se realiza una exposición de 40 segundos a una potencia de 40 Watts. Posteriormente se sumergen los cortes en PBS.
  • Tratamiento específico con el anticuerpo primario (anti Mac-1).
  • Incubación, en cámara humeda a 4ºC, durante 18 horas.
  • Lavado con PBS.
  • Detección utilizando el sistema Envision Plus de Dako. El mismo consiste en un polímero de dextrano acoplado a peroxidasa y al anticuerpo secundario. La sustancia reveladora fue la 3,3-diaminobencidina, que otorga un color marrón a las células marcadas.
  • Coloración de contraste con hematoxilina.
  • Deshidratación con alcoholes de concentración creciente
  • Aclaración con 2 baños de xilol.
  • Montaje con Balsamo de Canada.
Resultado: Las células que presentan el antígeno Mac1 se distinguen por su color marrón. En el resto de las células pueden observarse los núcleos azul violáceo.
Observación de los cortes:
Se utilizó un microscopio Olympus BX50. Se realizó una primera observación con magnificaciones de 40x, 200x y 400x. Esto permitió la elección de áreas de parénquima pulmonar sin vasos ni bronquios de gran tamaño. Posteriormente se utilizó un objetivo de inmersión (100x), con lo que se alcanzó una magnificación de 1000x. Se contaron, con cada técnica los macrófagos de 10 campos microscópicos por animal. Para el recuento se utilizó el programa Image Pro Plus for Windows.
Tratamiento estadístico de los datos obtenidos
Los datos obtenidos del recuento celular fueron estadísticamente analizados mediante el test de t para muestras no apareadas con varianza diferente. Los resultados estadísticamente significativos correspondieron a un valor de P < 0.05, mientras que los altamente significativos respondieron a un valor de P < 0.01.
 
RESULTADOS
En la siguiente gráfica se detallan los resultados obtenidos en cuanto al número de macrófagos observados con cada uno de los tratamientos realizados.
 
Efecto de un tratamiento con Bromesol y Avlosin sobre el número de macrófagos presentes en el pulmón de pollos parrilleros sanos - Image 1
Grupo 1: control sin tratamiento
Grupo 2: tratamiento con Aivlosin
Grupo 3: tratamiento con Bromesol
Grupo 4: tratamiento con Aivlosin + Bromesol
El número de macrófagos corresponde al promedio de las muestras observadas con las diferentes técnicas y expresados por milímetro cuadrado de superficie pulmonar.
Tabla de significación de los datos obtenidos mediante el test de t de muestras no apareadas con varianza diferente. En cada columna se detallan las diferencias estadísticas entre cada tratamiento en cuanto al número de macrófagos en tejido pulmonar. 
Efecto de un tratamiento con Bromesol y Avlosin sobre el número de macrófagos presentes en el pulmón de pollos parrilleros sanos - Image 2
Grupo 1: control sin tratamiento * : Diferencias significativas
Grupo 2: tratamiento con Aivlosin **: Diferencias altamente significativas
Grupo 3: tratamiento con Bromesol N/S: Diferencias no significativas
Grupo 4: tratamiento con Aivlosin + Bromesol
 
Microfotografías histológicas obtenidas de los distintos grupos, y con diferentes técnicas.
Giemsa 
Grupo 1 (control) ep60-0A-6g
Efecto de un tratamiento con Bromesol y Avlosin sobre el número de macrófagos presentes en el pulmón de pollos parrilleros sanos - Image 3
 
Grupo 2 (Aivlosin).ep60-1 A-7g
Efecto de un tratamiento con Bromesol y Avlosin sobre el número de macrófagos presentes en el pulmón de pollos parrilleros sanos - Image 4
 
Grupo 3. (Bromesol). Ep60- 1 A- 3g
Efecto de un tratamiento con Bromesol y Avlosin sobre el número de macrófagos presentes en el pulmón de pollos parrilleros sanos - Image 5
 
Grupo 4. (Aivlosin + Bromesol) ep 60- 4 B-6g
Efecto de un tratamiento con Bromesol y Avlosin sobre el número de macrófagos presentes en el pulmón de pollos parrilleros sanos - Image 6
 
Hematoxilina-Eosina
Grupo 1 (control) ep60-0B-7h
Efecto de un tratamiento con Bromesol y Avlosin sobre el número de macrófagos presentes en el pulmón de pollos parrilleros sanos - Image 7
 
Grupo 2 (Aivlosin) ep60-2 A-6h
Efecto de un tratamiento con Bromesol y Avlosin sobre el número de macrófagos presentes en el pulmón de pollos parrilleros sanos - Image 8
 
Grupo 3. (Bromesol) ep60- 4B-5h
Efecto de un tratamiento con Bromesol y Avlosin sobre el número de macrófagos presentes en el pulmón de pollos parrilleros sanos - Image 9
 
Grupo 4. /Aivlosin+Bromesol). Ep60- 1 A-10h
Efecto de un tratamiento con Bromesol y Avlosin sobre el número de macrófagos presentes en el pulmón de pollos parrilleros sanos - Image 10
Inmunohistoquímica (Antígeno Mac 1)
Grupo 1. (control) ep60- 0B-1i
Efecto de un tratamiento con Bromesol y Avlosin sobre el número de macrófagos presentes en el pulmón de pollos parrilleros sanos - Image 11
 
Grupo 2. (Aivlosin) ep60- 3B- 1i
Efecto de un tratamiento con Bromesol y Avlosin sobre el número de macrófagos presentes en el pulmón de pollos parrilleros sanos - Image 12
 
Grupo 3. (Bromesol) ep60- 1 A-5i
Efecto de un tratamiento con Bromesol y Avlosin sobre el número de macrófagos presentes en el pulmón de pollos parrilleros sanos - Image 13
 
Grupo 4. (Aivlosin+Bromesol) ep60- 4 A-10i
Efecto de un tratamiento con Bromesol y Avlosin sobre el número de macrófagos presentes en el pulmón de pollos parrilleros sanos - Image 14
 
CONCLUSIONES
Según se desprende del gráfico y la tabla de resultados, se observaron diferencias altamente significativas en el número de macrófagos entre los animales del grupo 4 (combinación de Bromesol y Aivlosin) con los animales de los grupos restantes como así también diferencias significativas entre el grupo de los animales tratados con Aivlosin y los del grupo control. Estas observaciones indican que las drogas estudiadas actúan como estimuladoras de los macrófagos pulmonares, corroborándose así los resultados de otros investigadores. En conclusión podríamos afirmar que aparte de las funciones específicas de cada una de estas drogas (antibiótica y mucolítica), las mismas podrían colaborar en la eliminación de los agentes infecciosos respiratorios gracias a sus propiedades inmunomoduladoras.
 
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Autores:
Raúl Cerdá
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