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Efecto del ozono sobre el crecimiento de bacterias y hongos de importancia avicola

Publicado: 1 de septiembre de 2011
Por: Javi Margus (Facultad de Ciencia y Tecnología, Universidad Autónoma de Entre Ríos (UADER) SC Gómez (Fac. de Humanidades, Artes y Ciencias Sociales, UADER), Dante Javier Bueno (EEA INTA Concepción del Uruguay) Entre Ríos, Argentina
Resumen

En este trabajo se evaluó la acción antimicrobiana del ozono frente a hongos y bacterias de importancia en avicultura. Se utilizaron 5 cepas de Aspergillus (4 Aspergillus fumigatus y 1 Aspergillus oryzae) y 5 cepas de Salmonella pertenecientes a distintos serovares. Una concentración fija de cada microorganismo inoculada en medio agarizado fue sometida a diferentes tiempos de aplicación de ozono (60g/h). El efecto del tiempo de exposición al ozono dependió de la cepa estudiada, aunque los hongos resultaron más resistentes que las bacterias. En referencia a los hongos, la disminución del número de esporas fue desde 11% al 91%. En 2 de las 5 cepas fúngicas utilizadas, 5 minutos de exposición con ozono fueron suficientes para disminuir estadísticamente el número de esporas de estos hongos, respecto al control. En las tres cepas restantes se necesitó la exposición de ozono por un mínimo de 10 minutos. En la mayoría de los hongos ensayados no se observó diferencia estadística en la disminución de las esporas fúngicas a partir de los 10 minutos de exposición al ozono. Por el lado de las bacterias, S. Orion y S. Agona resultaron ser más resistentes al efecto al tiempo de exposición del ozono en agar tripeína-soja y agar Mac Conkey, respectivamente. A partir de los 5 minutos de exposición se presentó una importante disminución de la carga bacteriana y a partir de los 10 minutos la disminución llegó a un 100% en casi todas las cepas. Bajo las condiciones de estudio utilizadas, se recomienda la aplicación de ozono por un mínimo de 5 minutos (5 g) y de 10 minutos (10 g) para disminuir de manera importante la cantidad de Salmonelas y Aspergillus sp., respectivamente.
Palabras Clave: Ozono, Aspergillus, Salmonella.

Introducción
El gas ozono no es más que oxígeno que ha sido impactado por una descarga eléctrica y el impacto de la descarga el oxígeno sufre una reagrupación tri-atómica. Debido a su reactividad regresa al estado de oxigeno rápidamente (Rubin, 2001). El uso del ozono se incrementó en los últimos años en el mundo entero, ante la preocupación cada día más del uso perjudicial de químicos como desinfectantes. Se conoce que este gas introducido en un ambiente realiza cuatro acciones fundamentales: microbicida, desodorante, oxidante y descontaminante. Debido a su altísimo poder oxidante y desinfectante comenzó a usarse en el mundo para una gran cantidad de aplicaciones enfocadas al tratamiento de aguas, aires y eliminación de olores, como así también poco a poco fue ganando terreno sobre su aplicación en el bienestar humano, de la flora y fauna (Ricaurte Galindo, 2006).

Su aplicación tiene grandes ventajas en el medio ambiente ya que en dosis pequeñas no tiene efectos secundarios, por lo tanto no contamina, siendo un poderoso agente sanitizante. El ozono puede reducir y limitar el uso tradicional de químicos usados para la desinfección, agregar una barrera más eficaz contra la contaminación como un esterilizador y desinfectante para ganar eficacia y eficiencia. Comparado con los productos clorados, el ozono ofrece muchas ventajas al ser utilizado en cualquiera proceso de producción de alimentos. También se encuentran grandes ventajas si las necesidades que se requieran implican el lavado, sanitización y desinfección de productos, materiales, superficies, instrumentos, maquinarias, tuberías, contenedores, prácticamente cualquier área o superficie (Ricaurte Galindo, 2006). Por ello, el objetivo de este trabajo fue evaluar la acción antimicrobiana del ozono frente a hongos y bacterias de importancia en avicultura.
 

Materiales & Métodos


Microorganismos y condiciones de cultivo
Se utilizaron 5 cepas de Aspergillus (4 Aspergillus fumigatus y 1 Aspergillus oryzae) y 5 cepas de Salmonella pertenecientes a distintos serovares. Todas pertenecían a la colección del Laboratorio de Sanidad Aviar de la EEA INTA Concepción del Uruguay, Entre Ríos, Argentina.

Las cepas fúngicas, aisladas de pulmón de aves comerciales o de material de cama para uso avícola, fueron identificadas de acuerdo a lo propuesto por Pitt & Hocking (1997) y Klich (2002). Las mismas fueron mantenidas a 4ºC en agar papa glucosado (APG, Merck, Alemania) en pico de flauta e incubadas a 25 ± 2ºC durante 7 días. Las esporas fúngicas fueron recogidas con una solución acuosa de Tween 80 al 0,05% (v/v). El recuento de conidios fue realizado empleando una cámara cuentaglóbulos (hemocitómetro), estandarizando la suspensión a una concentración final de aproximadamente 106 conidios/ml.

Las cepas de Salmonella fueron obtenidas de aislamientos de clara-yema, maple o hisopado cloacal de aves, tipificados según el esquema de Kauffmann- White por el Servicio de Enterobacteria del Instituto Malbrán (Buenos Aires, Argentina). Estas bacterias fueron mantenidas a 4ºC en caldo tripteína soja (CTS, Acumedia, Estados Unidos). Los cultivos de trabajo fueron obtenidos por siembra en agar tripteína-soja (ATS, Acumedia, Estados Unidos), luego se tomó una colonia y se la sembró en CTS, se incubó durante 8 hs a 35 ± 2ºC. Finalmente, los cultivos fueron incubados en el mismo medio durante 12-16 horas hasta obtener una concentración final de 108-109 Unidad Formadora de Colonia (UFC)/ml.
Equipo generador de ozono
Se utilizó un equipo de la empresa BUILTEC que generaba 60g/h de ozono con un consumo de lámpara de 15 W y una potencia de 2600 V.
Ensayo de inhibición en medio agarizado
Para el caso de los hongos, a partir de la suspensión de 106 conidios/ml se realizaron diluciones sucesivas hasta 103 conidios /ml. Se tomaron 0,1 ml de esta última y se sembraron en superficie con espátula de Drigalsky en agar Czapek-Dox modificado (Oxoid, Inglaterra) con el agregado de extracto de levadura (Merck, Francia) al 0,5%. El ozono fue inoculado a diferentes tiempos (5, 10, 15 y 20 minutos) través de un orificio (realizado en esterilidad) en la superficie de las placas de Petri. Se utilizó un control con la siembra del hongo (tiempo 0). Las diferentes colonias obtenidas a los 5 días de incubación a 25 ± 2ºC, fueron contadas y expresadas como UFC/placa. Para el caso de las bacterias, el cultivo original fue diluido hasta 103 UFC/ml y se sembró 0,1 ml de esta última en superficie con espátula de Drigalsky en ATS (Acumedia, Estados Unidos) y agar Mac Conkey (MC, Merck, Alemania). Luego, el ozono fue aplicado directamente sobre la placa con el medio y la siembra de la misma manera y en los mismos tiempos que para el caso de los hongos. También, se incluyó un control sin ozono con la siembra de la bacteria (tiempo 0). Posteriormente, las placas fueron incubadas a 35 ± 2 ºC durante 24 hs y luego las colonias bacterianas enumeradas en cada placa y expresadas como UFC/placa.
Análisis estadístico
Los resultados fueron informados como la media ± el desvío estándar de la misma. El número de conidios de hongos ó las colonias bacterias por placa de Petri fue analizado con el test de ANOVA balanceado. Las medias que mostraron diferencias significativas fueron comparadas usando el test de Tukey (Minitab Student R12). Todos los valores de significancia estadística están basados en un nivel de probabilidad de 0,05 (Rossman & Chance, 1998). Los ensayos fueron realizados por triplicado.
Resultados & Discusión
El efecto del tiempo de exposición al ozono dependió de la cepa estudiada, aunque los hongos resultaron ser más resistentes que las bacterias. En referencia a los primeros (Tabla 1), el ozono disminuyó el número de esporas en la cepa B0122 desde 19% a 72% respecto al control, en la cepa E0093-72 desde 29 a 91%, en la cepa C0131 desde 24 a 68%, en la cepa J2(-4)2 desde 11% a 62% y en la cepa E0093-70 desde 69% a 87%. En 2 de las 5 cepas fúngicas utilizadas (cepas C0131 y J2(-4)2) 5 minutos de exposición con ozono fueron suficientes para disminuir estadísticamente el número de esporas de estos hongos, respecto al control. En las tres cepas restantes se necesitó la exposición de ozono por un mínimo de 10 minutos. En la mayoría de los hongos ensayados no se observó diferencia estadística en la disminución de las esporas fúngicas a partir de los 10 minutos de exposición al ozono. Por otro lado, la cantidad de esporas viables respecto a las totales dependió de la cepa estudiada y estuvo entre 38,5 (cepa E0093-72) a 72% (cepa J2(-4)2).
Tabla 1. Efecto del ozono sobre la carga de diferentes cepas de Aspergillus de importancia en avicultura
Cepa
UFC totales inoculados
UFC/placa según el tiempo de exposición al ozono (en minutos)
10´
15´
20´
A. fumigatus B0122
212 ± 9*
146 ± 21A
118 ± 15AB
79 ± 12BC
40 ± 7C
41 ± 22C
A. fumigatus E0093-72
200 ± 29*
77 ± 29A
55 ± 16AB
28 ± 16BC
14 ± 4BC
7 ± 3C
A. fumigatus C0131
296 ± 19*
189 ± 17A
143 ± 15B
140 ± 7B
88 ± 9C
61 ± 12C
A. fumigatus J 2 (-4) 2 (C0153)
322± 12*
232 ± 17A
207± 4AB
167 ± 15B
104 ± 14C
89 ± 19C
A. oryzae E0093-70
296± 19*
137 ± 51A
43 ± 18B
42 ± 31B
29 ± 13B
18 ± 6B
A, B, C Medias con diferentes letras en la misma fila difieren significativamente (P<0,05).
La Tabla 2 muestra el efecto del ozono sobre la carga de diferentes cepas de Salmonelas ensayadas. S. Orion resultó ser más resistente al efecto al tiempo de exposición del ozono en TSA. Sin embargo, S. Agona mostró más resistencia al efecto del ozono en MC (datos no mostrados). A partir de los 5 minutos de exposición se presentó una importante disminución de la carga bacteriana y a partir de los 10 minutos la disminución llegó a un 100% en casi todas las cepas. Por otro lado, aunque la carga bacteriana en ATS fue inicialmente mayor respecto a lo crecido en MC (datos no mostrados), se observó una disminución importante con la aplicación del ozono. Esta carga mayor inicial puede ser explicada por la presencia de células dañadas de Salmonella que no crezcan en agar Mac Conkey, pero si en ATS.
Vijayanandraj et al. (2006) informaron que el ozono produjo la formación de micelio estéril en Aspergillus niger, que falló para producir esporas. Otros autores describen un efecto similar sobre otras cepas de Aspergillus (Antony-Babu & Singleton, 2009). Estos resultados concuerdan con lo encontrado en nuestros ensayos. Por otro lado, se ha informado la acción del ozono sobre distintas bacterias en el agua (Lescano et al., 1999; Restaino et al., 1995) y poco se ha investigado sobre la acción de este gas sobre Salmonelas de importancia avícola.
Tabla 2. Efecto del ozono sobre la carga de diferentes cepas de Salmonelas de importancia en avicultura
Tiempo Ozono
(minutos)
Cepas bacterianas y número de UFC/placa en agar tripteína soja (TSA)
ST1
SG2
SE3
SO4
SA5
0
39 ± 3A
97 ± 9A
75 ± 7A
103 ± 5A
122 ± 16A
5
2 ± 2B
1 ± 1B
0 ± 0B
14 ± 9B
1 ± 1B
10
0 ± 0B
0 ± 0B
0 ± 0B
0 ± 0C
4 ± 1B
15
0 ± 0B
0 ± 0B
0 ± 0B
0 ± 0C
1 ± 1B
20
0 ± 0B
0 ± 0B
0 ± 0B
0 ± 0C
1 ± 1B
A, B, C Medias con diferentes letras en la misma columna difieren significativamente (P<0,05). 1 Salmonella Typhimurium CUB 01/10, 2 Salmonella gallinarum CUB 05/10, 3 Salmonella Enteritidis CUB 06/10, 4 Salmonella Orion CUB 28/08, 5 Salmonella Agona CUB 07/10.
 
Conclusiones
La aplicación de ozono por un mínimo de 5 minutos (5 g) y de 10 minutos (10 g) es útil para disminuir de manera importante la cantidad de Salmonelas y Aspergillus sp. crecidos en medios de cultivos, respectivamente. Estos resultados resultan alentadores para estudiar el efecto del ozono sobre ambientes avícolas, donde pueden estar presentes los microorganismos nombrados anteriormente.
 
  • Antony-Babu S & Singleton I. 2009. Effect of ozone on spore germination, spore production and biomass production in two Aspergillus species. Antonie Van Leeuwenhoek 96:413-22.
  • Klich MA. 2002. Identification of common Aspergillus species. Ponsen & Looijen, Wageningen, The Netherland.
  • Lezcano I, Pérez Rey R, Baluja Ch, Sánchez E. 1999. Ozone Inactivation of Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Shigella sonnei and Salmonella typhimurium in Water. Ozone Sci. Eng. 21: 293-300.
  • Pitt JI & Hocking A. 1997. Fungi and food spoilage. 2º Edition, Blackie Academic and Professional, London, UK.
  • Restaino L, Frampton EW, Hemphill JB, Palnikar P. 1995. Efficacy of ozonated water against various food-related microorganisms. Appl. Environ. Microbiol. 61:3471-3475.
  • Ricaurte Galindo SL. 2006. Ozonoterapia una opción para el sector agropecuario. REDVET 7:1-16.
  • Rossman AJ & Chance BL. 1998. Workshop Statistics: discovery with data and Minitab. New York, Springer-Verlag.
  • Rubin MB. 2001. The History of ozone. The Schönbein period, 1839-1868. Bull. Hist. Chem. 26: 40-56.
  • Vijayanandraj VR, Nagendra Prasad D, Mohan N, Gunasekaran M. 2006. Effect of ozone on Aspergillus niger causing black rot disease in onion. Ozone Sci. Eng.28: 347-350.
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Autores:
Javi Margus
UADER
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Dante Javier Bueno
Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria - INTA
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Fabricio Lucero
Brasil Foods - BRF
4 de octubre de 2018

hola, me interesaria saber mas sobre este tema. donde se pueden conseguir estos equipos ?

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