Efecto de Butirato Sódico protegido (Gustor BP70) y su combinación con aceites esenciales (Natesse) en modelo de infección artificial para provocar Enteritis Necrótica en Broilers

Investigar el efecto de NATESSE (combinación de butirato sódico y aceites esenciales protegidos con grasa vegetal) y GUSTOR BP 70 (butirato sódico protegido con grasa vegetal) tras desafío con cepa Clostridium perfrigens A alfa-tóxica en broilers.

• Material y método:

Animales experimentales: Broilers de 1 día de edad (Babolna Híbrido)

Dietas: Alto contenido en proteína (25%) y libre de antibióticos. Sin coccidiostato ni antibiótico promotor del crecimiento.

Protocolo de infección: Simulación de Enteritis Necrótica Subclínica siguiendo la metodología Gholiamiandehkordy.

Tabla 1.- Calendario de protocolo de infección

En el día 16 se añadió la vacuna de Gumboro al agua de bebida para causar moderada inmunosupresión. La inoculación oral con 3-6 x 10⁵ CFU C. perfringens se hizo 3 veces diarias en los días 18,19, 20 y 21. En el día 19 los animales fueron vacunados con una dosis 10 veces la de una vacuna comercial viva atenuada que contenía oocitos para predisponer a los animales al factor clínico de la enfermedad.

30 animales experimentales fueron distribuidos al azar en tres grupos:

- Control Positivo: pienso sin aditivo en animales infectados con C. perfringens.
- BP70 infectado: 1.5 Kg GUSTOR BP 70 (butirato sódico protegido)/Tm en animales infectados con C. perfringens.
- Natesse infectado: 1.5 Kg Natesse (butirato sódico y aceites esenciales protegidos) /Tm en animales infectados con C. perfringens.

Todos los animales fueron tratados con vacuna Gumboro, vacuna viva de coccidio e infectados con C. perfringens A.

Tabla 2.- Diseño experimental.

El peso de los animales se midió durante el experimento en los días 3, 7, 10, 14, 17, 20 y 23.

- Observación patológica

Todos los animales se sacrificaron en el día 25 y las lesiones macroscópicas fueron anotadas siguiendo el método descrito por Gholamiandehkordi et al. (2007): 0=negative; 1=inflamación del intestino, 2=necrosis focal (1-2 cm) o cambios degenerativos en la mucosa, 3=necrosis desigual (3-4 cm); 4=necrosis difusa

- Exámen histopatológico

Se recogieron muestras de hígado, bazo, duodeno, yeyuno, ileum y pancreas. Se anotaron las lesiones microscópicas teniendo en cuenta necrosis, vellosidades, fusión, dilatación capilar, hemorragias capilares, defectos en células epiteliales, sangre y material proteinaceo en lumen intestinal, y presencia de enteritis. Cada parámetro fue evaluado de 0 a 2 puntos por animal y se calculó la media por tratamiento.

 

36 animales fueron divididos al azar en 6 grupos. Todos los animales fueron tratados con la vacuna de Gumboro y vacuna viva de coccidio. Los grupos C(-), BP70(-), Natesse (-) consisten en grupos control de animales no infectados con C. perfringens, mientras que los grupos C(+), BP70(+) y Natesse (+) fueron infectados con C. perfringens A.

- Control negativo: pienso sin aditivo y animales no infectados con C. perfringens
- Control positivo: pienso sin aditivo y animales infectados con C. perfringens
- BP70 no infectado: 1.5 Kg GUSTOR BP 70/Tm y animales no infectados
- BP70 infectado: 1.5 Kg GUSTOR BP 70/Tm y animales infectados
- Natesse no infectado: 1.5 Kg Natesse/Tm y animales no infectados
- Natesse infectado: 1.5 Kg Natesse/Tm y animales infectados

Tabla 3. Diseño experimental

Muestras: Los pollos se sacrificaron el día 22 y se tomaron muestras de yeyuno de aprox. 5 cm de longitud.

Se llevó a cabo la técnica PCR a tiempo real y los genes testados fueron:

IL-1β: "Llamados para ayudar" en caso de infección
IL-2: Inmunoestimulantes (promueven la proliferación de células T)
IL-8: Propiedad quimiotáctica para heterófilos (señal para que heterófilos acudan al lugar donde está la infección)
IL-10: Inhibe IL-2, propagando la respuesta humoral inmune (inflamación)
CD3: Cluster de diferenciación 3. Relacionado con el contaje de células T
LITAF: Lipopolisacárido induido por factor alfa de necrosis tumoral. Es una citosina TNF que aumenta en infecciones Gram-.
TNFSF15: Factor de crecimiento vascular endotelial. Está presente en las células endoteliales y también envuelto en la proliferación, diferenciación y apoptosis de células inmunes.

 

El peso de los animales alcanzado al día 17 (pre- infección) fue mayor para el grupo Natesse con respecto al control (p<0.05). Sin embargo no hay diferencias en el día 23 (post- infección).

Fig 1. Pesos corporales antes y después de la infección con C. perfringens para pollos alimentados con Gustor BP 70 y Natesse

Los resultados del examen patólogico a nivel macroscópico muestran que Natesse tiene menor puntuación que el control positivo (p<0.05). Los resultados del examen histopatológico están en consonancia con los anteriores (p<0.07). Tabla 4.

Tabla 4. Resultados de puntuación patológica e histopatológica de los grupos control, Gustor BP70 y Natesse.

Fig 2. Puntuación total (cambios Macroscópicos y Microscópicos) en los grupos control, Gustor B70 y Natesse.

 

Este análisis se planteó para mostrar los efectos immunomoduladores de los compuestos dados en pollos no infectados y en esos pollos tras la infección para producir enteritis necrótica. En la tabla 5 se muestra la comparación de la expresión genética (aumento o reducción) entre grupos.

Gustor BP70 indujo al aumento de IL-2 y disminución de LITAF: Eso supone mayor respuesta inmune y menos células muertas.

Natesse aumentó los niveles IL-1β, IL-2 y CD3, y bajó los niveles de IL-10 y TNFSF15: Aumentó significativamente la respuesta del sistema inmune y disminuyó fuertemente la inflamación y muerte celular.

Tabla 5: Aumentó y disminución de citocinas-genes

 

La adición de Gustor BP70 no produjo ningún cambio en la expresión de niveles de los genes investigados. Natesse causó diversos efectos en la producción de citocinas.

Tres de los genes investigados aumentaron: IL-1β (p=0 0.028), IL-2 (p=0.026) and CD3 (p=0.011) mientras que TNFSF15 disminuyó (p=0.004). El aumento de IL-1 y IL-2 se refiere a la activación en cascada de la respuesta immune, resultando en estimulación de la proliferación linfocitaria y maduración. Esta observación se confirma con el aumento de la expresión genética de CD3 que representa un elevado contaje de células T. Podemos decir que la interacción entre butirato sódico y aceites esenciales parece provocar alteraciones en el perfil de expresión genética.

 

El tratamiento Gustor BP 70 resultó en un aumento significativo de la expresión de IL-2 (p= 0.002) y una disminución significativa de la expresión de LITAF (p=0.003). El elevado nivel de IL-2 es estadístico y también biológicamente importante, indicando un efecto estimulante inmune de esta sustancia en pollos infectados. En el caso del tratamiento Natesse la expresión genética de IL-2 aumentó y TNFSF15 disminuyó significativamente (p=0.001).

 

• CONCLUSIONES: