Caracterizacion molecular de 68 virus de la infeccion de la bolsa de fabricio obtenidos en mexico durante el periodo de 2008 a 2011

El virus de la Infección de la Bolsa de Fabricio pertenece a la familia Birnaviridae, con tres géneros designados según la especie que afectan como Aquavirnavirus que infecta a peces, Entomobirnavirus a insectos y el Avibirnavirus que afecta a las aves, específicamente al pollo causando la Infección de la Bolsa de Fabricio (IBF). El Avibirnavirus cuenta con dos serotipos, si embargo, solo el serotipo 1 afecta al pollo. Para la clasificación del virus de la IBF existen varios métodos como son las pruebas de neutralización cruzada, a través de un panel de anticuerpos monoclonales, también por la ptogenicidad de las cepas y las técnicas moleculares que se han utilizado en los últimos años como la principal herramienta ara la clasificación del vIBF. Las técnicas moleculares que se han utilizado son la prueba de PCR-RFLP (Reacción en Cadena por la Polimerasa-Patrón de la Longitud  de los Fragmentos de Restricción) y la secuenciación genética. Las técnicas moleculares se han generalizado, entre otras razones porque son altamente sensibles, no requieren de la replicación del virus o incluso se pueden trabajar con muestras inactivadas, pero es importante considerar para su correcta interpretación que los grupos moleculares formados por cada técnica difieren unos de otros según la técnica utilizada, y no siempre  corresponden a los grupos antigénicos o protectivos.

Uno de las primeros trabajos sobre pruebas moleculares realizadas a virus de la IBF de México fue publicado por Banda et al en 2003 (2) en el que reportó que, además de la presencia de virus clásicos o estándar, virus que no eran tipificables. En 2007, el Dr. D. Jackwood encontró de cuatro cepas obtenidas de México que estaban relacionadas en cienrto grado con variantes americanas, pero que formaban un grupo bien diferenciado de éstas (3). En ANECA de 2009 fue reportado la caracterización molecular por la técnica de secuenciación de 38 virus de la IBF obtenidos de diferentes estados de México que mostraron características de virus variantes pero bien diferenciado de las variantes americanas. Estos virus formaban dos grupos bien definidos, donde también aparecía la cepa 11153 reportada por Banda en 2001 (4) como un “tipo nuevo” de virus.

De esta manera, el objetivo de éste trabajo es presentar una actualización sobre la caracterización molecular del virus de la IBF obtenidas de granjas comerciales durante el período de 2008 a 2011. 

Virus. Se tomaron improntas de Bolsa de Fabricio en tarjetas FTA (Whatman®) de pollos de engorda de 28 días de edad en promedio provenientes de granjas comerciales de nueve estados de México (Nuevo León,  guascalientes, Jalisco, Querétaro, México, Hidalgo, Morelos, Veracruz y Chiapas) durante el período de 2008 a 2011. 

PCR. La purificación del RNA viral de las tarjetas FTA se realizó con los kits de extracción de RNA y MagMax para aislamiento del RNA viral de Life- Technologies® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La PCR anidada se desarrolló siguiendo los procedimientos descritos por Liu et al 1994 y Lin et al 1993 (6,7). Los primers usados amplifican el producto de 474 pb, que abarcan del sitio 703 al 1176 de la región hipervariable del gen que codifica la PV-2 del virus de la IBF. 

Secuenciación y análisis filogenético. El producto de PCR fue purificado usando QIAquick PCR de QIAGEN® y secuenciado usando el BigDye Terminator Cycle Sequencing kit de Applied-Biosystems® de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Las secuencias de los virus obtenidos se alinearon con virus relevantes obtenidos de la base de datos GenBank con el método Clustal W Multiple Alignement. Las diferencias en la secuencia se calcularon con el método paramétrico de Kimura-2, y el árbol filogenético se construyó usando el programa de TREECOM para Windows (8).

Las 68 muestras probadas en éste estudio resultaron positivas al virus de la IBF por PCR. Por secuenciación, éstos virus mexicanos se agruparon cerca de las variantes americanas pero en dos grupos bien separados de  éstas. Todos los aislamientos están clasificados como variantes, pero como no tiene relación estrecha con los virus de otros países las designamos como varinates mexicanas. 

El grupo 1 de variantes mexicanas, que contiene 34 aislamientos, apareció en mayor número en estados del norte del país, mientras que el grupo 2 fue más característico del centro y sur. Dentro del grupo 1 aparece el virus 11153/US reportado por Banda et al (4) como un virus variante de Estados Unidos diferenciado de las variantes americanas de referencia. El grupo 2 mostró características únicas con respecto al resto de las cepas de referencia usadas en el árbol filognético. Este grupo 2 de variantes mexicanas contiene, además de las cepas probadas en éste estudio, dos cepas aisladas en el período de 1999 a 2001 y también hay una cepa aislada en el 2004. El patrón de secuencia de éste grupo de cepas mostró un residuo de aminoácidos únicos para el grupo (254Q, 270K, 278S, 317K y 312P).

Finalmente, las cepas clásicas aparecen en la parte inferior del árbol filogenético, y debajo de éstas están las cepas muy virulentas de la IBF. 

El análisis filogenético de 68 aislamientos del virus de la IBF provenientes de granjas comerciales de pollo de engorda en México los agrupó junto con las cepas variantes, sin embargo, con características únicas que las separan de las cepas variantes de referencia.  Este hallazgo coincide y confirma lo reportado por Jackwood, Banda y Lechuga con anterioridad (2,3 y5). Las variantes mexicanas forman dos grupos bien definidos dentro del árbol filogenético. El grupo 1, con predominancia en el norte del país está alineado junto con el virus 11153 de Estados Unidos, y tomando en cuenta la relación geográfica con México, el origen de éste grupo podría estar vinculado con éste virus. 

Con respecto al grupo 2 de variantes mexicanas, éstas no tienen cercanía con ningún virus de referencia internacional sino con virus aislados en México durante el período de 1999 a 2004. Esto marca cierta estabilidad de los virus en términos de genética pero también de su persistencia en parvadas de pollo de engorda. Esta última situación nos haría cuestionar la eficiencia o la eficacia de los programas de vacunación si consideramos el trabajo presentado por Cookson 2005 (9), donde mostró los posibles efectos de la vacunación sobre la prevalencia de las poblaciones del virus de la IBF en un período de cinco años, en la que los virus clásicos tienden a disminuir su prevalencia, la variante E muestra estabilidad y los que aumentan su presencia en granjas son virus diferentes de los clásicos.

En éste estudio no se encontraron cepas del virus d la IBF que presentaran características de alta virulencia, situación que coincide con muchas observaciones de campo, donde lo que se observa es, principalmente, inmunodepresión y asociación con agentes secundarios así como la baja productividad. Con frecuencia, cuando se habla de cepas variantes del virus de la IBF se cree que éstas son muy virulentas pero no lo son. Las cepas variantes tienen una amplia distribución en Estados Unidos y Lationoamérica, y lo característico para éstos virus es que generan una rápida atrofia de la Bolsa de Fabricio sin pasar casi por la fase de edema-inflamación pero no causan mortalidad por si mismas en contraste con las cepas clásicas muy virulentas. Debido a las diferencias antigénicas, los anticuerpos maternos generados con vacunas con cepas clásicas virulentas proveen solo inmunidad parcial contra éstas variantes. 

En resumen, Los virus encontrados en éste estudio pertenecen al grupo de variantes mexicanas, y éstas no mostraron tener relación con las variantes americanas y tampoco mostraron características de alta virulencia. Para tener mayor conocimiento sobre éstos virus así como su significado biológico es necesario correr pruebas in vivo. 

1. Banda A., Villegas P. And El-Attrache J.. Molecular caracterization of Infectious Bursal Disease virus from comercial poultry in the United States and Latin America. Avian Diseases 47:87-95, 2003 

2. Banda A., Villegas P. El-Attrache J. And Estévez C. Molecular Characterization of seven field isolates of Infectious Bursal Disease virus obtaines from comercial broiler chickens. Avian Diseases 45:620-630, 2001 

3. Cookson K. El uso de la Reacción en Cadena por la Polimerasa para supervisar el estado de la infección de la Bolsa de Fabricio en pollo de engorda, en campo. 54th Western  Poultry Diseases Conference,  Vancouver, Canadá, 2005.
4. Jackwood D., Sommer S. Genetic Characteristics of Infectious Bursal Disease viruses from four continents. Virology 365:369-375, 2007. 

5. Lechuga M., Morfín R., Etcharren L., Palya V. Situación apizootiológica del virus de la Infección de la Bolsa de Fabricio en México. XXXIV Convención ANECA, 2009 

6. Lin Z., Kato A. Otaki Y, Nakamura T., Sasmas E. And Veda S. Sequence comparison of highly virulent Infectious Bursal Disease prevalent en JApan. Avian Diseases 37:315-323, 1993 

7. Liu H., Giambrone J. And Dormitorio T. Detections of genetic variations in serotype 1 of Infectious Bursal Disease Virus using Polymerase Chain  Reaction and Restriction Endonuclease Analysis. Journal of Virological Methods 4:281-291. 1994

8. Saif M. Diseases of poultry 11th edition. Infectious Bursal Disease. P 161-179, 2003 

9. Van de Peer and Wacher R. TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary tres for the MS Windows wnvironment. Computer Applictions in the Biosciences 10:569-570. 1994 

 

Tabla 1. Arbol filogenético de virus de la IBF 2008-2011.