Vacunación contra sigatoka negra en plátano

Combate de la sigatoka negra mediante la vacunación con esporas atenuadas de la enfermedad de las musáceas conocida como sigatoka negra, utilizando el método conocido como vacunación. Como es bien sabido el hombre ha podido combatir enfermedades muy severas y mortales como el sarampión, la viruela, la tifoidea y muchas otras usando el patógeno del agente causal de cualquiera de ellas y atenuado usarlo como un inductor de resistencia contra el mismo patógeno. Ahora si funciona perfectamente o con éxito en la medicina humana y también animal ¿porqué no debería funcionar en las plantas también? . Bueno esa fue la pregunta y reto que propuse dilucidar en esta investigación que les presentaré. Para ello, presenté la idea en un congreso en mi país y motive a algunos aventureros en estos retos del conocimiento humano y encontré dos especialistas afines: un fitopatólogo y un biotecnólogo que quisieron participar en dicha investigación, que les mostraré a continuación. Es bien sabido que tanto en el reino animal, del cual somos parte y del vegetal, existen mecanismos de defensa naturales o adquiridos que se activan ante un agente patógeno que acecha. Me referiré en este caso a las plantas. Sabemos que las plantas en su centro de origen ha convivido con sus enemigos y ha creado algunos métodos de comunicación a nivel genético bioquímico de defensa conocido como Relación Hospedero-patógeno y que les ha permitido sobrevivir a ambos a través del tiempo y que ha servido como una relación de comunicación entre ambos. Generándose a nivel genético genes de virulencia y de avirulencia, un mecanismo de defensa patógeno-hospedero y reconocida a nivel celular y bioquímico, donde se activan los mecanismos de defensa planta-patógeno y hoy entendidas como SAR, SIR: Sistema de Resistencia Adquirida y Sistema de Resistencia Inducida, una es dominante y otra recesiva. Después de este pequeño resumen, voy a meterme de lleno en la investigación que hemos realizado el equipo de investigadores de dos universidades importantes de mi país Costa Rica, la Universidad de Costa Rica (UCR) y el Instituto Tecnológico de Costa Rica (ITCR). Objetivo de la investigación: crear una vacuna con cepas atenuadas del patógeno, un hongo, que causa una de las enfermedades más dañinas del grupo de las Musáceas (banano y plátano) conocida como Sigatoka negra causada por el hongo Mycospharella figiensis var. Morelet, mediante el método de la vacunación con cepas atenuadas del patógeno causal de la enfermedad. Existen una serie de compuestos que están asociados con la defensa de la planta y que son activados por el SAR, ellos son: fitoalexinas, enzimas oxidativas e hidrolíticas, reacciones de oxidación–reducción, formación de peróxidos, estrangulamiento de la pared celular o engrosamiento de la misma, liberación de péptidos anti microbianos, apoptosis, entre otros, estos procesos o mecanismos de acción o respuesta del hospedero hacia el patógeno se le conoce como reacción de hipersensibilidad (HR) (Kuc, 2001). La reacción de hipersensibilidad está regida por proteínas de patogenicidad (PR) que pueden ser expresadas de forma constitutiva e inducida en respuesta a la infección, se pueden localizar tanto en los espacios inter como intracelulares, lo que las hace a veces ser básicas o ácidas, se han encontrado de preferencia almacenadas en las vacuolas y el núcleo de la célula (Yun et al., 1997). La Sigatoka negra es una enfermedad que provoca en ambos cultivos (banano y plátano), pérdidas significativas y que, en el cultivo del banano, su combate cuesta a las empresas bananeras nada menos que $ 1.500 por ha y por año (25% de los costos totales), además, el uso creciente de los fungicidas utilizados con frecuencia, han creado resistencia del hongo, causante de la enfermedad a varios de los productos comerciales. Se dice que se tardan diez años en obtener y liberar un nuevo producto para el mercado y en poco tiempo el hongo rompe o inactiva su eficiencia, creando resistencia a dicho producto (Guzmán, et al., 1998). El costo tan alto es motivo de buscar alternativas más eficientes de combate que abaraten los mismos y especialmente que se evite la gran contaminación de las cuencas hidrográficas que conlleva este tipo de combate químico en las zonas productoras de banano y plátano del país y del mundo. Procedimiento: El proyecto se realizó en las siguientes etapas: I. Etapa: a) Se obtuvieron aislamientos a partir de material infectado proveniente de plantaciones comerciales de banano y plátano: se tomaron muestras de Mycospharella fijiensis var. diformis, agente causal de la Sigatoka negra del plátano y banano. Estas muestras fueron llevadas al laboratorio de patología donde se realizaron cultivos monospóricos mediante el método de descarga. Luego se purificaron y propagaron masivamente en medio PDA. b) Se prepararon suspensiones de conidios de aislamientos provenientes de banano y plátano, estimando una concentración infecciosa, para determinar este valor se utilizó el hematocitómetro o cámara “Neubauer”. La suspensión madre se utilizó inmediatamente para la inoculación de plantas sanas. c) Cada una de las suspensiones fueron aplicadas por medio de un aspersor manual (aerógrafo) con capacidad de 40cc, en las hojas de las plantas de plátano y banano a nivel de invernadero (Inoculación). d) Durante esta etapa se verificaron los síntomas producidos por el efecto del hongo sobre el tejido de las plantas infectadas, estos síntomas se evaluaron y cuantificaron con ayuda de una tabla de “grado de incidencia” y de severidad (Escalas de Stover y de Fouré). e) Se repitieron los pasos del b al d. f) Se evalúo el progreso de la enfermedad. En todos los casos se utilizó un testigo, inoculado únicamente con agua destilada. Las plantas al momento de la inoculación, fueron aisladas con una cortina de plástico para evitar la deriva. II. Etapa: a) El rastreo de genes de resistencia ó proteínas de resistencia (PR), se realizó utilizando las pruebas ya establecidas de biología molecular, buscando “marcadores moleculares” que estén asociados a genes de resistencia. El componente molecular es importante para el proyecto debido a que estas técnicas constituyen una herramienta fundamental para identificar, caracterizar y conocer los genes involucrados en el proceso de activación de la resistencia a plagas y enfermedades. b) Una vez que se obtuvo aislamientos puros de M. fijiensis, se realizó la extracción de ADN y su evaluación por medio de marcadores específicos para determinar la presencia de posibles haplotipos con menor virulencia en la población de sigatoka negra en plátano. aislamientos de M. fijiensis provenientes de 2 hospederos (plátano y banano) que presenten bajos niveles de virulencia, también llamados cepas inhibidas, bajo la hipótesis de que dichos aislamientos pueden ser utilizados como un agente activador de mecanismos de resistencia en Musáceas, que contribuyan a retrasar los procesos infecciosos del patógeno. Sin embargo, la demostración de los niveles de virulencia de un aislamiento patogénico depende en gran medida del éxito del proceso de inoculación que permita poner en contacto al patógeno con las secciones susceptibles del hospedero. En este caso se utilizó la técnica de aspersión de una suspensión del patógeno sobre hospederos susceptibles, dicha técnica permite una aplicación homogénea, rápida y de bajo costo, con la generación de datos comparables en poco tiempo. Se aisló el hongo de la sigatoka negra y se hicieron varias diluciones, las cuales fueron probadas a nivel de invernadero en plantas de plátano sanas obtenidas de cormos sanos y desinfectados y sembradas en recipientes de plástico en tierra desinfectada y libre de patógenos. La suspensión de M. fijiensis se preparó a partir de un volumen de 9 ml de agua destilada el cual se hizo pasar por cada placa utilizada para desprender el material infectivo. A partir de esta suspensión se tomó 3 muestras de 20 µl para realizar conteos de conidios con un hematocitómetro Neubauer y estimar la concentración de la suspensión, expresada en conidios ml-1. Las suspensiones madre utilizadas presentaron una concentración mayor de 1 x 105 conidios ml -1. Antes de realizar el proceso de inoculación a la suspensión madre se le agregó 1ml de disolución de gelatina al 0,5% como adherente. El proceso de inoculación se realizó con un aerógrafo (Badget modelo 150-11M) aplicando 2 ml de la suspensión en el lóbulo derecho de la cara abaxial o envés de la hoja número 2 al momento de la inoculación, con el fin de mantener un área específica para las evaluaciones de los síntomas de la enfermedad. Luego de la inoculación se restringió el riego por 4 horas con el objetivo de que el inoculo se adhiriere. Las evaluaciones del avance de la enfermedad se iniciaron 10 días después del proceso de inoculación de acuerdo con lo descrito por Barrios (2006). Se realizaron observaciones rutinariamente cada 5 días hasta los 35 días después de la inoculación (DDI). Posteriormente, las evaluaciones se realizaron cada 7 días hasta completar los niveles de las escalas utilizadas. La estimación del avance de la enfermedad se realizó mediante 2 escalas de evaluación. La Escala Fouré, en la cual se considera la evolución de la enfermedad de acuerdo con los síntomas y los signos que se presentan en el hospedero, esta escala se compone de 6 niveles de avance, donde el nivel 6 presenta lesiones necrosadas y bajo condiciones de campo se puede observar el desarrollo de signos del patógeno. La segunda escala utilizada fue la escala Stover modificada por Gauhl, en la cual el avance de la enfermedad se mide en función del porcentaje de área de la hoja afectada por lesiones provocadas por la infección causada por el patógeno (Orjeda 1998). Se utilizó un total de 10 aislamientos de M. fijiensis, 3 provenientes de material infectado de plátano y 7 obtenidos de material infectado de banano. Se evaluó 4 plantas/aislamiento, 2 de plátano Dominico-Harton y 2 de banano cv Williams, además, se registró 2 plantas más de cada hospedero a las cuales se les aplicó agua destilada estéril con gelatina (testigo absoluto) para un total de 44 plantas en observación. Las plantas inoculadas se mantuvieron bajo condiciones de invernadero mientras que la distribución de las mismas fue completamente al azar, con el fin de disminuir los posibles efectos de la distribución de la luz y la temperatura en el invernadero. El análisis estadístico se realizó mediante la comparación de medias entre los distintos tratamientos para lo cual se utilizó el programa estadístico InfoStat ®. Posteriormente se realizó una segunda experiencia con el mismo sistema para verificar la eficiencia del modelo propuesto. Sin embargo, este segundo evento consideró mejoras a partir de los resultados previamente obtenidos. El avance de la infección se observó tanto en plantas de banano como de plátano lo que demuestra que el proceso de inoculación con aerógrafo es efectivo bajo las condiciones utilizadas, el desarrollo de síntomas se observó a partir de los 10 DDI, caracterizado por periodos de avance de la enfermedad, activos entre los 10 y 25 DDI, así como periodos relativamente constantes después de los 30 DDI. La colonización de estomas y desarrollo de estructuras reproductivas, confirma la capacidad de los aislamientos de generar el proceso infeccioso y las sucesivas etapas de Sigatoka negra. Las hojas inoculadas presentaron distintos avances de la enfermedad de acuerdo con el aislamiento utilizado, en algunas de las hojas 10 DDI, se observaron los primeros estadios de las escalas, mientras que en otras, los síntomas de la infección del patógeno no fueron evidentes en este tiempo, en este periodo los síntomas observados en ciertas hojas de plátano inoculadas se caracterizaron por la presencia de un halo clorótico que inhibió el desarrollo de las lesiones, o bien las mantuvo latentes por varios días por debajo del 5% del área afectada. Esto valida la hipótesis de que existen diferentes niveles de virulencia entre los aislamientos utilizados al provenir de la recombinación genética del patógeno por mecanismos sexuales para la formación de ascoporas, demostrando además la necesidad de explorar otras regiones de su genoma que permitan explicar la presencia de regiones codificantes para características de la virulencia. La aparición de lesiones avanzadas de la enfermedad (estadios Fouré 5 y 6) se presentó a los 49 DDI, con tejidos necrosados por encima del 40% principalmente en las hojas de banano. En plantas de plátano inoculadas, el desarrollo de la enfermedad en este periodo resultó lento, la infección recién alcanzaba lesiones necrosadas según la escala Fouré, con una severidad promedio menor del 40% de acuerdo con la escala de Stover modificada por Gauhl .De acuerdo con los resultados obtenidos, aislamientos como MB31, MB32 y MB310, presentaron virulencia considerable desde el inicio de las evaluaciones al completar hitos de avance de las escalas en corto tiempo, mediciones en el tiempo acerca del avance de los síntomas son frecuentemente utilizadas como forma de comparación de la virulencia entre aislamientos; en este caso la dispersión de las curvas de avance de la enfermedad desarrolladas por los aislamientos es baja, expresando con esto que la duración de la formación de síntomas fue similar y mostrando síntomas avanzados. A los 42 DDI se observó el desarrollo de los estadios finales de la escala Fouré. Por otra parte, en el hospedero plátano se presentó un desarrollo de la enfermedad lento, en ambas escalas se presentaron valores no superiores al 15% con lesiones necrosadas de poco avance incluso después de 42 días de evaluación, esto confirma lo reportado por estudios previos en los que se reconoce una resistencia parcial del hospedero ante M. fijiensis. Cabe destacar que en el caso de este hospedero las infecciones resultaron similares indiferentemente de la procedencia del aislamiento, caracterizadas por periodos de poco avance entre los 20 y 35 DDI.Las dos escalas de evaluación utilizadas fueron efectivas para registrar el avance de la infección; sin embargo, debido a que el tamaño de las hojas de los hospederos es variable en el ancho y largo, fue necesario el mejorar la evaluación con la escala Stover modificada por Gauhl, introduciendo una plantilla cuadriculada para medición del daño en la hoja por la enfermedad. Las modificaciones propuestas para la segunda experiencia del ensayo de inoculación permitieron la estandarización en la toma y estimación de los datos. El análisis estadístico determinó que la principal diferencia en patogenicidad de los aislamientos evaluados se presentó a los 28 DDI, dato que coincide con los reportes de desarrollo de lesiones avanzadas cercano a los 30 días después de inoculado (Alvarado Capó et al 2002, Acosta Suárez et al 2004; Abadie et al. 2008). La comparación de medias entre la severidad de los aislamientos evaluados con la escala Fouré (p= 0,0120) y la escala Stover modificada (p=0,0170), a los 28 DDI, resultó significativa lo cual sugiere que la patogenicidad difiere entre los aislamientos. en el hospedero banano, siendo para esta experiencia los aislamientos MB32 y MB31, los que presentaron los menores niveles de agresividad para dicho periodo (anexo 5), sin que por esto se pueda establecer que resultan aislamientos atenuados debido a que al final del periodo de evaluación completaron los niveles de las escalas de severidad. Sin embargo, esta diferencia en el desarrollo de los síntomas sugiere la existencia de diversos niveles de agresividad entre los aislamientos obtenidos. En cuanto a la severidad de los aislamientos en el hospedero plátano en general resultó baja, presentándose diferencia significativa al comparar las medias obtenidas con la escala Fouré (p= 0,0165) sólo con respecto al tratamiento control, esto demuestra la resistencia parcial de este cultivo en particular a los aislamientos provenientes de banano. Mientras que la comparación de medias con la escala Stover modificada por Gauhl, separó significativamente (p=0,0084) el daño causado por los aislamientos, siendo el MB38 y MB32, los que provocaron un menor daño 28 DDI, con niveles de menor o igual a 5% correspondiente a la escala de Stover a grado 2. Este grado es fácilmente manejable a nivel de campo sin la necesidad de aplicaciones de agroquímicos de alto costo económico.La adaptación realizada en cuanto a la obtención del inoculo por medio de la filtración con tela resultó efectiva para la eliminación de posibles residuos que obstruyan el dispositivo de aplicación, no obstante, generó una reducción en el recuento de estructuras reproductivas. El inoculo utilizado resultó igualmente infectivo, pero es conveniente el uso de un material más poroso en posteriores estudios para lograr una mayor cantidad de material experimental disponible.La presencia de un solo haplotipo en los individuos estudiados revela la necesidad de estudiar otras regiones del genoma de M. fijiensis, con el objetivo de relacionar la caracterización a nivel de biología molecular con la patogenicidad de los aislamientos.Conclusiones • Se implementó la técnica para la recuperación de cultivo monospóricos de Mycosphaerella fijiensis, así como una colección de dichos aislamientos, los cuales podrán ser utilizados en próximos ensayos. • La caracterización molecular estableció que la especie presente tanto en banano como en plátano es Mycosphaerella fijiensis. La población estudiada está conformada por un solo haplotipo, común a ambos hospederos, según la secuencia de una región del gen de la Actina. Es necesario aumentar el número de aislamientos estudiados (al menos 100 aislamientos procedentes de un mismo hospedero) antes de poder afirmar que solo un haplotipo está presente en ambas poblaciones. • El método de inoculación con aerógrafo resultó efectivo para la inoculación de M. fijiensis a plantas de banano y plátano a nivel de invernadero, al lograr inducir síntoma en las áreas foliares donde se aplicó la suspensión respectiva de conidios en nebulización de manera más homogénea. • En este sentido la adaptación empleada en este experimento permitió la evaluación de un área similar entre los distintos materiales inoculados, para la obtención de datos más exactos y comparables. Las escalas de avance de la enfermedad utilizadas son viables bajo condiciones de invernadero. • Se identificaron aislamientos de banano que resultaron menos agresivos, como MB38, MB32 y MB31, que presentaron bajos niveles de agresividad a los 28 DDI, con niveles de menor o igual a 5% correspondiente a la escala de Stover a grado 2. Estos aislamientos pueden ser utilizados en futuras experiencias en campo para validar la hipótesis del uso de cultivos inhibidos en la activación de mecanismos de defensa en Musaceas. Recomendaciones Realizar estudios posteriores que incluyan otras regiones del genoma del patógeno, en particular aquellas que estén relacionadas con la producción y liberación de moléculas asociadas a los mecanismos de defensa de los hospederos estudiados, a fin de determinar la presencia de otros haplotipos, su relación con los hospederos y con la virulencia hacia los mismos. El uso de micro satélites es otra alternativa que se observó que fueron efectivos en la identificación de haplotipos en aislamientos locales y que podría ser otra herramienta muy apropiada en la caracterización e identificación molecular del hongo Mycospharella fijiensis. Es recomendable poder realizar algunos ensayos adicionales a nivel de invernadero en plantas de plátano, utilizando aquellas cepas que presentaron baja agresividad, para evaluar su efecto en la detención del desarrollo del hongo, para confirmar su eficiencia y estabilidad. Probar a nivel de campo el efecto de las cepas atenuadas seleccionadas (élite) en la activación del desarrollo de la enfermedad como un producto biológico en el control de Sigatoka negra.