Control biológico de Fusarium graminearum: utilización de Trichoderma spp. y biofumigación con parte aérea de Brassica juncea

La mayoría de las plantas cultivadas sufren enfermedades causadas por hongos de distintas especies del género Fusarium ⁽³⁰⁾. Particularmente, Fusarium graminearum Schwabe [Teleomorfo Gibberella zeae (Schw.) Petch.] es un patógeno vegetal de significativa importancia económica. Entre las enfermedades que provoca en trigo y otros cereals de invierno se destacan: la fusariosis de la espiga, el pietín y el tizón de plántulas; en maíz causa la podredumbre de la espiga y del tallo ^{(24, 26)}. En el cultivo de trigo este patógeno adquiere características particularmente deletéreas porque afecta tanto el rendimiento como la calidad de los granos (poder germinativo, vigor, contenido de proteínas, aptitud panadera de la harina y otros parámetros tecnológicos). Al margen de estas deficiencias, la consecuencia más seria de la fusariosis de la espiga de trigo es la contaminación de los granos y sus derivados, con micotoxinas ⁽³⁰⁾.

Fusarium graminearum sobrevive en el suelo en tejidos vivos y muertos, y sus ascosporas, macroconidios, clamidosporas y fragmentos de micelio sirven como inóculo, siendo el rastrojo la fuente de propágulos más significativa ⁽⁶⁾. En el caso particular de la fusariosis de la espiga de trigo, se emplean diferentes estrategias para su control, que incluyen la utilización de semillas sanas, la rotación de cultivos, la aplicación de fungicidas, el empleo de cultivares resistentes y diferentes prácticas de labranza; no obstante ninguna de estas estrategias aplicadas en forma independiente es capaz de reducir considerablemente el impacto de esta enfermedad ⁽²⁴⁾.

Los métodos de control biológico, integrados a las prácticas culturales, podrían colaborar en la prevención y en la disminución de la incidencia y severidad de las enfermedades provocadas por este patógeno. En este aspecto, se presentan como métodos promisorios la biofumigación y la aplicación del hongo antagonista Trichoderma spp. ^{(24, 31, 40)}.

La biofumigación puede definirse como el control de plagas y patógenos edáficos por medio de la liberación en el suelo de compuestos, en su mayoría volátiles, originados por la descomposición de residuos orgánicos ⁽¹⁵⁾. Como biofumigantes se pueden emplear estiércoles, residuos agroindustriales y de cosechas, incorporación de plantas de Brassicáceas, sorgo, maíz, etc. Durante el proceso de biofumigación, como resultado de la descomposición del material orgánico, se generan en el suelo sustancias con actividad biocida como amonio, ácido acético, compuestos azufrados, etc. Además, si se incorporan al suelo plantas de Brassicáceas, los glucosinolatos presentes en sus tejidos ⁽²¹⁾, se hidrolizan por la acción de la enzima mirosinasa y se producen diferentes tipos de isotiocianatos, con variable grado de toxicidad frente a hongos patógenos u otros organismos ^{(16, 18, 28, 42)}. Entre las especies de Brassicáceas más estudiadas como biofumigantes se encuentra Brassica juncea L. Czerniak (mostaza parda), que ha demostrado tener efecto fungistático sobre diversos hongos fitopatógenos: Fusarium sambucinum Fuckel ^{(23, 25)}, Pythium ultimum Trow ^{(8, 23)}, Rhizoctonia solani Kühn ^{(8, 23, 38)}, Phytophthora spp. ^{(13, 23, 43)}, Verticillium dahlia Kleb. ^{(11, 27)}, Fusarium oxysporum Schlechtend.: Fr. f. sp. lycopersici (Sacc.) W. C. Snyder & H. N. Hansen ⁽¹¹⁾, Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary ⁽²³⁾, Sclerotinia minor Jagger ⁽¹⁰⁾, F. graminearum ⁽³¹⁾, etc.

Gran variedad de especies fúngicas han sido evaluadas como agentes biocontroladores, no obstante Trichoderma spp. se destaca claramente en este tipo de estudios por su facilidad de cultivo y el amplio rango de patógenos que controla ⁽⁴⁰⁾.

Los hongos del género Trichoderma son frecuentes en todo el mundo y pueden aislarse fácilmente desde el suelo, de troncos caídos y de otros restos vegetales en descomposición. Clasificados dentro de los hogos imperfectos, poseen una elevada tasa de crecimiento y producen un gran número de esporas asexuales (conidios) de color verde o blanco a partir de células conidiógenas situadas en el extremo de conidióforos ampliamente ramificados ^{(17, 19)}. Varias especies de este género son de importancia económica dado que sintetizan enzimas industriales (como celulasas y hemicelulasas) y antibióticos. Además poseen acción biocontroladora ⁽²²⁾, como consecuencia de la elevada tasa de crecimiento, la producción de metabolitos con actividad antibiótica y la manifestación de micoparasitismo ante diversos patógenos ⁽¹⁷⁾.

La actividad lítica sobre las paredes celulares de los hongos, debida a la acción de las enzimas 1,3-β-glucanasa y quitinasa, es uno de los principals mecanismos responsables de la actividad antagonista sobre patógenos de suelo ⁽³⁶⁾. Adicionalmente, en algunas especies del género Trichoderma se reportó la capacidad de inducir resistencia en plantas como otro mecanismo de biocontrol ^{(7, 41)}.

Diversos autores determinaron la capacidad biocontroladora de distintas especies del género sobre un amplio rango de patógenos. Trichoderma harzianum Rifai, posiblemente la especie más estudiada, manifestó efecto antagonista sobre R. solani, Sclerotium rolfsii Sacc., Phytium aphanidermatum (Edson) Fitz ⁽³⁶⁾, Aphanomyces cochlioides Drechsler, Phoma betae (A. B. Frank), Acremonium cucurbitacearum Alfaro-García, W. Gams et J. García-Jiménez, F. oxysporum f. sp. radicis lycopersici Jarvis & Shoemaker ⁽¹⁷⁾, F. oxysporum f. sp. asparagi S.I. Cohen & Heald ⁽²⁾, F. oxysporum f. sp. Cumini (Foc), Alternaria burnsii Uppal, Patel & Kamat ⁽¹²⁾, Phytophtora capsici Leonian, Pyrenophora tritici- repentis (Died.) Drechsler, P. ultimum, S. sclerotiorum ⁽⁴⁰⁾, Phytophtora nicotianae Breda de Haan ⁽³⁷⁾ y Colletotrichum dematium (Pers. Ex Fr.) Grove ⁽³⁶⁾. Asimismo, Trichoderma hamatum (Bonord.) Bain. exhibió efecto biocontrolador sobre R. solani; Trichoderma longibrachiatum Rifai sobre P. ultimum; Trichoderma viride Pers. ex Fr. sobre R. solani; Trichoderma virens (Miller, Giddens & Foster) v. Arx sobre Pythium arrhenomanes Drechsler, P. ultimum, R. solani, F. graminearum (40), F. o. cumini y A. burnsii ⁽¹²⁾; Trichoderma gamsii Samuels & Druzhinina y Trichoderma velutinum Bissett, C.P. Kubicek & Szakacs manifestaron biocontrol sobre Fusarium culmorum (W. G. Sm.) Sacc. y F. graminearum ⁽²⁴⁾.

Los conocimientos actuales sobre la técnica de biofumigación refieren principalmente al biocontrol de organismos perjudiciales para los cultivos, pero es limitada la información relativa a su efecto sobre la flora y fauna benéfica. En este aspecto, los antecedentes del efecto de la biofumigación sobre hongos del género Trichoderma son escasos. Kirkegaard & Matthiessen ⁽²⁰⁾ argumentaron que son necesarias bajas concentraciones de isotiocianatos para detener el crecimiento de ciertos patógenos como Sclerotinia spp. o Pythium spp., pero para afectar a Trichoderma spp. se requieren dosis treinta veces superiores. En pruebas in vitro, Sanchi et al. (2005) observaron que S. sclerotiorum y S. minor fueron más sensibles que la cepa T39 de T. harzianum a los isotiocianatos liberados por Brassica carinata Braun. Por otro lado, Dandurand et al. (2000) reportaron que la biofumigación con Brassica napus L. puede ser incompatible en combinación directa con T. harzianum.
 

 

El material vegetal utilizado para la biofumigación fue la parte aérea de plantas de B. juncea (mostaza parda), cultivadas en el campo experimental del Instituto Fitotécnico de Santa Catalina (IFSC), Llavallol, Argentina. El cultivo se sembró en mayo de 2012; cuando alcanzó el estadio de fin de fructificación (en octubre del mismo año), se cosechó la parte aérea.

La cepa de F. graminearum utilizada fue la LM2010, identificada por el Instituto Fitotécnico de Santa Catalina y el Centro de Referencia de Micología, Universidad Nacional de Rosario (CEREMIC - UNR).

El hongo Trichoderma spp. se obtuvo del producto comercial Biagro TL® (5 x 108 conidios de Trichoderma spp. x ml-1), formulado biológico generado a través de un convenio de vinculación tecnológica entre el IFSC y el laboratorio Biagro S.A., a base de cepas nativas aisladas del campo experimental del IFSC ^{(3, 4, 5)}.

 

Evaluación del efecto biofumigador de B. juncea sobre Trichoderma spp. Y F. graminearum.

El ensayo realizado para determinar el efecto biofumigador de B. juncea sobre el crecimiento de Trichoderma spp. y de F. graminearum se basó en la metodología llevada a cabo por otros autores para probar la eficacia de fungicidas volátiles sintéticos y biofumigantes ^{(8, 13, 25, 33, 43)}.

Los dos tercios superiores de la parte aérea de las plantas de B. juncea se segaron y llevaron al laboratorio.

El material cosechado se lavó con agua destilada estéril, se cortó en trozos pequeños y se trituró en una procesadora durante aproximadamente un minuto.

El material triturado se colocó en recipientes de plástico de 900 ml, en dos dosis de 5 y 10 g.

Previamente, las cepas de Trichoderma spp. y F. graminearum se multiplicaron por separado en medio agar papa glucosado (APG) al 2%, durante siete días a 25±2°C y oscuridad. Se extrajeron discos del cultivo de 5 mm de diámetro de la parte más externa de las colonias y de activo crecimiento micelial, y se transfirieron de a uno a cajas de Petri con medio APG al 2%.

Las cajas de Petri con un disco de F. graminearum o de Trichoderma spp. Se colocaron de a una dentro de los recipientes que contenían el biofumigante, apoyadas sobre soportes de plástico, quedando elevadas 2 a 3 cm por encima del material vegetal triturado. Los recipientes se cerraron con tapas plásticas. Para el tratamiento control se siguió la misma técnica pero no se utilizó material vegetal biofumigante.

Determinación del biocontrol de Trichoderma spp. sobre F. graminearum Para analizar el potencial antagónico de Trichoderma spp. sobre F. graminearum se utilizó la técnica de cultivo dual ⁽²⁹⁾. Se colocaron en cajas de Petri con medio de cultivo APG al 2%, un disco de 5 mm de diámetro de F. graminearum y otro de Trichoderma spp., ubicados a una distancia de 4 cm uno del otro. Las cajas de Petri se colocaron dentro de recipientes de plástico de 900 ml y éstos se cerraron con tapas.

Estudio de la combinación de Trichoderma spp. y la biofumigación con B. juncea para el control de F. graminearum

Para evaluar el efecto conjunto de Trichoderma spp. y la biofumigación con B. juncea sobre el crecimiento de F. graminearum, se utilizó el cultivo dual combinado con la técnica de biofumigación, anteriormente descriptos.

 

En todos los ensayos, los recipientes de plástico con sus respectivos contenidos fueron incubados en cámara de crecimiento durante siete días, a 25±2°C y oscuridad.

 

Finalizado el período de incubación, se midieron y analizaron los diámetros de las colonias de ambos microorganismos. En el cultivo dual se realizaron observaciones microscópicas en la zona de interacción de ambos microorganismos para identificar mecanismos antagónicos. A fin de evaluar el efecto combinado de Trichoderma spp. y la biofumigación, se calculó el porcentaje de inhibición miceliar de F. graminearum (I) mediante la siguiente fórmula ^{(32, 39)}:

donde:

C = diámetro de la colonia del patógeno en el control.
T = diámetro de la colonia del patógeno tratada con Trichoderma spp. y el biofumigante B. juncea.

 

Se utilizó un diseño completamente aleatorizado con cinco repeticiones por tratamiento. El tratamiento de los datos se realizó mediante un ANOVA simple y la comparación de medias con la prueba de Tukey. Cuando los datos no cumplieron los supuestos de normalidad, homocedasticidad y aleatoriedad, se aplicó estadística no paramétrica mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Los datos se analizaron con el programa Statistica 7.

 

En todos los tratamientos, el hongo Trichoderma spp. colonizó íntegramente las cajas de Petri y sus colonias presentaron el mismo diámetro que el control sin biofumigante (p value = 1; H = 0) (tabla 1 y figura 1C; 1F; 1I, pág. XXX). La biofumigación con B. juncea no inhibió el crecimiento de las colonias de Trichoderma spp. en ninguna de las dosis evaluadas.

Tabla 1. Efecto de la biofumigación con B. juncea sobre el crecimiento de las colonias de Trichoderma spp.

Los valores con letras distintas indican diferencias significativas por la prueba de Kruskal-Wallis (p value = 1; H = 0).

Los resultados de este trabajo concuerdan parcialmente con aquellos obtenidos por otros investigadores que analizaron el efecto de la biofumigación de otras Brassicáceas sobre Trichoderma spp. Por ejemplo Sanchi et al. (2005) demostraron en pruebas in vitro que la cepa T39 de T. harzianum fue menos sensible a los gasesbiofumigantes de B. carinata que S. sclerotiorum y S. minor; Galletti et al. (2008) analizaron in vitro el efecto de la biofumigación con harina de semilla de B. carinata sobre 40 aislados de Trichoderma spp., y hallaron que fueron menos sensibles a los gases que todos los patógenos ensayados (P. ultimum, R. solani, F. oxysporum), aunque observaron un efecto fungistático sobre Trichoderma spp. a la dosis más alta del biofumigante. Por lo tanto, la biofumigación con Brassicáceas afectaría en diferente medida el crecimiento de Trichoderma spp., en función de la dosis, especie botánica y órgano utilizado del biofumigante.

 

Figura 1. Crecimiento de las colonias de F. graminearum y Trichoderma spp. Tratadas con B. juncea. A, B, C: sin biofumigante; D, E, F: con 5 g de B. juncea; G, H, I: con 10 g de B. juncea; Fg: F. graminearum; T: Trichoderma spp.

 

Las colonias de F. graminearum resultaron de diámetro similar a la del tratamiento control en las dos dosis utilizadas (p value = 0,3832) (tabla 2, pág. XXX y figura 1B; 1E; 1H). La biofumigación con B. juncea no inhibió el crecimiento de F. graminearum.

 

Tabla 2. Efecto de la biofumigación con B. juncea sobre el crecimiento de las colonias de F. graminearum.

Los valores con letras distintas indican diferencias significativas por la prueba de Tukey (p value = 0,3832).

En un trabajo previo donde se evaluó in vitro el efecto fungistático de la biofumigación con B. juncea sobre F. graminearum ⁽³¹⁾, se observó inhibición del crecimiento del hongo con dosis de 10 g de B. juncea. Sin embargo, a diferencia del presente ensayo, el estadio fenológico de la mostaza parda fue el de plena fructificación y la temperatura de incubación fue 20°C. Posiblemente una o ambas disimilitudes en la metodología explicarían las diferencias halladas en los resultados. Por un lado, la concentración de glucosinolatos varía según el estadío fenológico de las Brassicáceas ^{(25, 43)}.

En cuanto a la temperatura de incubación, F. graminearum presenta una tasa de crecimiento mayor a 25°C que a 20°C ⁽¹⁾. Todo lo anteriormente expuesto indicaría que la biofumigación con B. juncea, tendría un efecto variable sobre la supresión del crecimiento de F. graminearum, dependiendo del estadio fenológico de la mostaza y/o de la temperatura de incubación.

 

En el cultivo dual, las colonias de F. graminearum resultaron de diámetro significativamente menor que las del tratamiento control, en cambio las colonias de Trichoderma spp. presentaron el mismo diámetro que en el control (p value = 0,0003; H = 18,53) (tabla 3 y figura 1A; 1B; 1C, pág. XXX). El hongo biocontrolador Trichoderma spp. inhibió significativamente el crecimiento de las colonias de F. graminearum. En observaciones microscópicas realizadas en la zona de interacción de ambos microorganismos se identificaron dos mecanismos antagónicos de Trichoderma spp. sobre F. graminearum: micelio envolvente (coiling) y vacuolización.

Tabla 3. Acción antagonista de Trichoderma spp. sobre F. graminearum.

Los valores con letras distintas indican diferencias significativas por la prueba de Kruskal-Wallis (p value = 0,0003; H = 18,53).

Estos resultados coinciden con los obtenidos por otros autores quienes observaron biocontrol de F. graminearum por acción antagónica de T. virens ⁽⁴⁰⁾, T. gamsii y T. velutinum ⁽²⁴⁾.

 

La combinación del antagonista Trichoderma spp. y la biofumigación con B. juncea tuvo un efecto sinérgico en el control del crecimiento de F. graminearum: el porcentaje de inhibición miceliar en los tratamientos que combinaban las dos técnicas fue significativamente mayor que el del tratamiento en el que solo se utilize Trichoderma spp. No se observaron diferencias significativas entre las distintas dosis de B. juncea (p value = 0,0035) (tabla 4 y figura 1A; 1D; 1G, pág. XXX).

Tabla 4. Efecto de la combinación de Trichoderma spp. y de la biofumigación con B. juncea sobre el crecimiento de F. graminearum, expresado a través del porcentaje de inhibición miceliar.

Los valores con letras distintas indican diferencias significativas por la prueba de Tukey (p value = 0,0035).

 

Este es el primer reporte sobre biocontrol in vitro de F. graminearum empleando en forma conjunta al hongo antagonista Trichoderma spp. y la biofumigación con B. juncea.

Otras investigaciones relacionadas con este tema han reportado resultados similares.

Sanchi et al. (2005) observaron que la combinación de T. harzianum - T39 con la biofumigación con B. carinata no suprimió la actividad antagonista del hongo biocontrolador frente a S. sclerotiorum y S. minor, pero los metabolitos volátiles de Trichoderma redujeron la eficiencia de los isotiocianatos para inhibir el crecimiento miceliar de esos patógenos; no obstante, concluyen que la biofumigación con B. carinata puede ser considerada compatible con la aplicación de T. harzianum - T39.

Galletti et al. (2008) encontraron un efecto sinérgico de los dos métodos del control biológico, en un ensayo realizado en suelo bajo condiciones controladas, aplicando en forma separada y conjunta, Trichoderma spp. y la biofumigación con harina de semilla de B. carinata. Ellos midieron luego la incidencia de la mortalidad de plántulas de remolacha azucarera provocada por P. ultimum y observaron que el mayor control de la enfermedad se logró cuando la biofumigación se aplicó en combinación con Trichoderma spp.

 

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