Biofumigación con Brassica juncea L. Czerniak y Sinapis alba L. Acción sobre el crecimiento in vitro de Trichoderma spp. y Azospirillum brasilense Tarrand, Krieg et Döbereiner

INTRODUCCIÓN

En los programas de manejo integrado de plagas es frecuente combinar diversas tácticas para lograr, ecológica y económicamente, un manejo eficiente de una plaga dentro del agroecosistema. Por ello resulta fundamental conocer la compatibilidad de las tácticas aplicadas para evitar interferencias entre las mismas. Algunas tácticas de manejo, como son la biofumigación, la aplicación de Trichoderma spp. y de Azospirillum spp. demostraron ser eficientes en el control de numerosos patógenos. Sin embargo, resulta escasa la información concerniente a la compatibilidad entre estas técnicas.

La biofumigación consiste en la supresión de organismos edáficos nocivos, por medio de la liberación de compuestos originados durante la descomposición de especies de brassicáceas (1, 2). Los conocimientos actuales sobre la técnica de biofumigación se refieren, principalmente, al biocontrol de organismos perjudiciales para los cultivos (3, 4, 5), pero es limitada la información relativa a su efecto sobre los microorganismos benéficos del suelo, como Trichodermaspp. y Azospirillum spp.

La técnica de biofumigación estimula la actividad de los microorganismos descomponedores del suelo, pues son directamente responsables de la degradación del material incorporado (6). La biofumigación produce cambios en la estructura y la función de la comunidad microbiana del suelo que se relacionan, principalmente, con cambios en la disponibilidad del sustrato microbiano, derivados de la modificación del suelo con materiales orgánicos (7). Qiujun et al. (8) observaron que la biofumigación con colza incrementó la diversidad bacteriana y disminuyó la diversidad de hongos del suelo.

Varias especies del género Trichodermaposeen acción biocontroladora como consecuencia de la elevada tasa de crecimiento, la producción de metabolitos con actividad antibiótica y la manifestación de micoparasitismo ante diversos patógenos (9). El control biológico de Trichodermaspp. abarca un amplio rango de patógenos (10, 11, 12).

Dentro del grupo de las bacterias rizosféricas promotoras del crecimiento vegetal (PGPR), el género Azospirillum es el más intensamente estudiado (13). Además de tener un efecto benéfico para el crecimiento de las plantas, numerosas investigaciones mencionan a Azospirillum spp. con significativa actividad de control biológico (14, 15).

Los antecedentes del efecto de la biofumigación sobre hongos del género Trichoderma son escasos. Kirkegaard y Matthiessen (2) argumentaron que son necesarias bajas concentraciones de isotiocianatos para detener el crecimiento de ciertos patógenos, como son Sclerotinia spp. o Pythium spp.; pero para afectar a Trichoderma spp. se requieren dosis 30 veces superiores. Dandurand et al. (16) informaron que la biofumigación con Brassica napus L. puede ser incompatible en combinación directa con Trichodermaharzianum Rifai. Por su parte, Salem (17) trabajó con paja de arroz enriquecida con Trichoderma spp. y observó que la biofumigación con ese sustrato actuó en forma sinérgica con el hongo Trichoderma en el control de patógenos de suelo.

Actualmente, no se conocen antecedentes relativos al efecto de la biofumigación sobre las bacterias del género Azospirillum. Qiujun et al. (18) estudiaron el efecto in vitro de la biofumigación con harina de colza sobre la PGPR Bacillus amyloliquefaciens (ex Fukumoto 1943) Priest et al. 1987 emend. Wang et al. 2008 y observaron que el biofumigante inhibió su crecimiento. Otros investigadores mencionaron la utilización combinada de la biofumigación con Brassica juncea L. Czerniak y Bacillus subtilis (Ehrenberg) Cohn para el control de tizón del arroz (19, 20, 21).

El objetivo de este trabajo fue evaluar el efecto in vitro de la biofumigación con B. juncea y Sinapis alba L. sobre el crecimiento de Trichoderma spp. y Azospirillum brasilense Tarrand, Krieg et Döbereiner, con la finalidad de determinar la posibilidad de la utilización combinada de estas tácticas de manejo de plagas.

MATERIALES Y MÉTODOS

El material vegetal utilizado para la biofumigación fue la parte aérea de plantas de B. juncea(mostaza parda) yS. alba(mostaza blanca), cultivadas en el campo experimental del Instituto Fitotécnico de Santa Catalina (IFSC), Llavallol, Argentina. El cultivo se sembró en mayo de 2013; cuando alcanzó el estadio de fin de fructificación (en octubre del mismo año), se cosechó la parte aérea.

El hongo Trichoderma spp. se obtuvo del producto comercial Biagro TL® (5 x 108 conidios de Trichoderma spp. x ml-1 a la fecha de su elaboración), que consiste en un formulado biológico generado a través de un convenio de vinculación tecnológica entre el IFSC y el laboratorio Biagro S.A., a base de cepas nativas aisladas del campo experimental del IFSC (22).

La bacteria A. brasilense se obtuvo de un inoculante comercial con una concentración de 1 x 10⁷ x ml^-1 al momento de su elaboración.

Los ensayos realizados se basaron en una modificación de la metodología utilizada por Mayton et al. (4) para seleccionar genotipos de Brassica spp. que producen compuestos fungicidas volátiles. Los dos tercios superiores de la parte aérea de las plantas de B. junceay S. albase segaron y se llevaron al laboratorio. El material cosechado se lavó con agua destilada estéril, se cortó en trozos pequeños y se trituró en una procesadora durante un minuto aproximadamente. El material triturado se colocó en recipientes de plástico de 900 ml, en dosis de 5, 15, 25, 35 y 55 g.

Previamente, la cepa de Trichoderma spp. se multiplicó en medio agar papa glucosado (APG) al 2%, durante siete días a 25±2ºC y en oscuridad. De ese cultivo se tomaron discos de 5 mm de diámetro que se extrajeron de la parte más externa de las colonias y de activo crecimiento micelial; se transfirieron, de a uno, a cajas Petri con medio APG al 2%.

Por otro lado, se obtuvieron los cultivos de A. brasilense mediante la técnica de siembra en placa por extensión en superficie, en medio Rojo Congo (RC) (23). Se realizaron diluciones decimales sucesivas hasta 10^-6 de inoculante comercial en solución fisiológica con 0,01% de Tween 80. Luego se sembraron 100 μl de dilución por caja Petri.

Las cajas Petri con un disco de Trichoderma spp. y las inoculadas con A. brasilensese colocaron, de a una, dentro de los recipientes que contenían el biofumigante, apoyadas sobre soportes de plástico y elevadas 2 a 3 cm por encima del material vegetal triturado. Los recipientes se cerraron con tapas plásticas. Para el tratamiento control se siguió la misma metodología pero no se utilizó material vegetal biofumigante.

Los recipientes de plástico con sus respectivos contenidos se incubaron en cámara de crecimiento durante siete días, en oscuridad. La temperatura de incubación fue de 25±2ºC para Trichodermaspp. y de 31±2ºC para A. brasilense.

Finalizado el periodo de incubación, se midió el diá- metro de las colonias de Trichodermaspp. y se cuantificó el número de unidades formadoras de colonias (UFC) de A. brasilense por caja Petri.

Se utilizó un diseño experimental completamente aleatorizado con cinco repeticiones por tratamiento. El análisis de los datos de A. brasilense se realizó mediante un ANOVA simple y la comparación de medias con la prueba de Tukey. En el caso de la evaluación del efecto de B. juncea sobre A. brasilense, los datos no cumplieron los supuestos de normalidad, homocedasticidad y aleatoriedad; por ese motivo se transformaron mediante la raíz cuadrada y se sometieron al mismo análisis estadístico y a una regresión simple. Los datos de Trichoderma spp. no registraron varianza, por lo tanto, se aplicó estadística no paramétrica mediante la prueba de Kruskal-Wallis. Los análisis se efectuaron con el programa Statistica 7.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Efecto de la biofumigación con B. juncea y S. alba sobre Trichoderma spp.

En todos los tratamientos, el hongo Trichodermaspp. colonizó íntegramente las cajas Petri y sus colonias presentaron el mismo diámetro que el control sin biofumigante (p value = 1; H = 0). La biofumigación con B. juncea y S. albano inhibió el crecimiento de las colonias de Trichoderma spp. en ninguna de las dosis evaluadas.

Estos resultados concuerdan con los de un trabajo previo donde no se observó inhibición del crecimiento in vitro de las colonias de Trichoderma spp. con dosis de 5 y 10 g del biofumigante B. juncea (5).

Resultados similares hallaron otros investigadores que analizaron el efecto de la biofumigación de otras brassicáceas sobre Trichodermaspp. En pruebas in vitro, Sanchi et al. (24) observaron que Sclerotinia sclerotiorum (Lib.) de Bary y Sclerotinia minor Jagger fueron más sensibles a los isotiocianatos liberados por Brassica carinata Braun que la cepa T39 de T. harzianum. Galletti et al. (25) analizaron in vitro el efecto de la biofumigación con harina de semilla de B. carinata sobre 40 aislados de Trichodermaspp. y hallaron que fueron menos sensibles a los gases que todos los patógenos ensayados (Pythium ultimum Trow, Rhizoctonia solani Kühn, Fusarium oxysporum Schlechtend.: Fr.), aunque observaron un efecto fungistático sobre Trichodermaspp. a la dosis más alta del biofumigante.

Efecto de la biofumigación con B. juncea y S. alba sobre A. brasilense

En los tratamientos con dosis de 15 g o más de B. juncea, la cantidad de UFC de A. brasilensefue significativamente inferior que en el control sin biofumigante (p value = 1,9 x 10^-14) (Tabla 1).

El número de UFC de A. brasilense disminuyó a medida que se incrementó la dosis de B. juncea. A los datos observados se ajustó un modelo de regresión exponencial, que ofreció un elevado coeficiente de determinación (R² =0,828; S = 0,316; p value = 3,2 x 10^-13) y respondió a la ecuación: Y = 55,679 * e^-0,0718*X, donde Y representa las UFC de A. brasilense por caja Petri y X es la dosis de B. juncea (Fig. 1).

TABLA 1. Efecto de la biofumigación con B. juncea y S. alba sobre el número de unidades formadoras de colonias (UFC) de A. brasilense.

FIGURA 1. Unidades formadoras de colonias (UFC) de A. brasilense por caja Petri en respuesta a las dosis crecientes del biofumigante B. juncea.

Biofumigación con Brassica juncea L. Czerniak y Sinapis alba L. Acción sobre el crecimiento in vitro de Trichoderma spp. y Azospirillum brasilense Tarrand, Krieg et Döbereiner - Image 2

La biofumigación con 15 g o más de B. juncea inhibió el crecimiento de las colonias de A. brasilense, según modelo exponencial negativo; la inhibición fue mayor cuanto mayor fue la dosis del biofumigante (Fig. 1).

Los tratamientos con 25, 35 y 55 g del biofumigante B. juncea provocaron, además, alteraciones morfológicas macroscópicas en las colonias, las cuales presentaron forma atípica y coloración rosada con halo mucoso.

Los tratamientos con S. alba no registraron diferencias significativas en el número de UFC de A. brasilense con respecto al control sin biofumigante ni entre las distintas dosis (p value = 0,1118) (Tabla 1). La biofumigación con S. alba no inhibió el crecimiento de las colonias de A. brasilense en las dosis evaluadas.

Este es el primer reporte sobre el efecto de la biofumigación con B. juncea y S. alba sobre el crecimiento de la bacteria A. brasilense.

CONCLUSIONES

Los resultados in vitro sugieren que la técnica de biocontrol con el hongo antagonista Trichoderma spp. sería compatible con la biofumigación con B. juncea y S. alba. En cambio, el biocontrolador A. brasilense solo sería compatible con el biofumigante S. alba y con dosis bajas de B. juncea, ya que con dosis de 15 g o más de B. juncea se inhibe significativamente el crecimiento de la bacteria.

Los estudios in vitro realizados son la base para la ejecución de los ensayos en campo que permitirán determinar fehacientemente la compatibilidad de estos métodos de control biológico.

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