México: Rubulavirus porcino - Enfermedad del ojo azul: la Proteína F como antígeno

"Producción, purificación y valoración antigénica de la proteína de fusión (f) del rubulavirus porcino, expresada en la levadura pichia pastoris” es el nombre de la investigación que realizara M.C. Luis Ignacio Siañez Estrada en su tesis presentada para obtener el grado de Doctor en ciencias químicas área de Bioquímica y Biología molecular para en posgrado en ciencias químicas en la Facultad de Ciencias Químicas de la Benemérita Universidad Autonóma de Puebla. Los Directores de Tesis fueron Dra. Irma Herrera Camacho (ICUAP-BUAP) y el Dr. Gerardo Santos Lopez (CIBIOR-IMSS).

En la introducción de su tesis de 124 páginas, con el respaldo de 41 figuras y 7 tablas, el autor señala:

El Rubulavirus porcino (RVP) también llamado virus de La Piedad Michoacán (LPMV), es el agente etiológico de la enfermedad del ojo azul en cerdos. Esta enfermedad causa signos neurológicos, respiratorios y reproductivos, los cuales pueden estar acompañados de opacidad corneal. La enfermedad del ojo azul genera pérdidas económicas causadas por la alta tasa de mortalidad de neonatos y la infertilidad en los adultos [1, 2]. Se trata de un virus envuelto con un genoma de ARN monocatenario en sentido negativo, presenta seis proteínas estructurales: la nucleoproteína (NP), la proteína mayor (L), la fosfoproteína (P), la proteína de matriz (M) y dos glicoproteínas de membrana, la hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y la proteína de fusión (F) [3].

La enfermedad del ojo azul puede presentar diferentes signos y lesiones, los cuales varían dependiendo de la edad del cerdo. En cerdos en etapa de lactancia se presentan manifestaciones nerviosas progresivas, agudas y fatales [2]. En cerdos de 3 a 4 meses de edad las manifestaciones neurológicas son escasas y la tasa de mortalidad es baja. Pero en cerdos adultos los signos se limitan primordialmente al aparato reproductor. En hembras adultas se pueden presentar abortos, neonatos y una considerable reducción en la fertilidad. En machos adultos se ha observado epididimitis (inflamación severa en la cabeza del epidídimo), formación de granulomas, orquitis, atrofia testicular y una sensible pérdida de fertilidad debido a una reducción notable en la motilidad y concentración de espermatozoides [2, 4]. La opacidad corneal se presenta solamente en 1 a 10% de los animales infectados de cualquier edad [2].

El diagnóstico de la enfermedad se realiza principalmente por la presencia de los signos clínicos como los ya mencionados, aunque se debe considerar que la encefalitis y fallas reproductivas pueden ser ocasionadas por otros virus que afectan cerdos. Las muestras de sangre se pueden utilizar para realizar inhibición de hemaglutinación, neutralización viral y pruebas de ELISA, donde se ocupan anticuerpos específicos contra el virus. La prueba de inhibición de la hemaglutinación es la más empleada, aunque frecuentemente puede dar falsos positivos. Se ha reportado la detección del RVP mediante RT-PCR en tiempo real, pero estas pruebas son caras e implican un costo alto para el productor. Por lo tanto, existen campos de oportunidad para el desarrollo de pruebas rápidas, ya sea para la detección de anticuerpos específicos, o bien para la detección del antígeno viral, ya que parte importante del control de la enfermedad se basa en un diagnóstico rápido y acertado que permita realizar acciones para disminuir la propagación del virus a otros animales y a otras granjas [5].

Por lo cual es importante generar un método de control y prevención de la enfermedad. Una de las estrategias posibles es producir proteínas presentes en la envoltura del virus y emplearlas como posibles vacunas. El RVP posee dos glicoproteínas insertadas en su envoltura: La hemaglutinina-neuraminidasa (HN) y la proteína de fusión (F), las cuales tienen como función el reconocimiento del receptor sobre la célula hospedera (HN) y la fusión de las membranas celular y viral para que la célula pueda ser infectada. Estas proteínas son candidatos para desarrollar un método de prevención [1]. El desarrollo de posibles vacunas en la actualidad esta auxiliado por el uso de la inmunoinformática, la cual permite evaluar antígenos in silico, determinando la posibilidad de inducir diversas respuestas en el sistema inmune sin necesidad de expresar la proteína. La evaluación de las proteínas de RVP empleando estas metodologías podría fortalecer la selección y diseño de futuros antígenos contra de RVP.

La producción de proteínas empleando la levadura Pichia pastoris es ampliamente utilizada. P. pastoris es un sistema de expresión común de proteínas debido a la capacidad de la levadura de realizar modificaciones post-traduccionales similares a otras células eucariotas, generando proteínas recombinantes funcionales y con la capacidad de generar una respuesta inmune. Otras ventajas que ofrece el sistema de expresión son el tiempo de crecimiento y expresión de la proteína, el cual es relativamente rápido comparándolo con otros sistemas de expresión eucariotas. Por lo cual, expresar y producir las proteína virales es un paso importante en el desarrollo de nuevas herramientas de detección y prevención de la enfermedad del ojo azul. El empleo de las proteínas HN y F, en conjunto, como posible vacuna puede que genere un efecto sinérgico en la respuesta inmune.

Aunque el RVP ha circulado en México al menos 40 años, el reto es erradicar la enfermedad, por lo que es importante centrarse en tres puntos importantes. Primero, en el desarrollo de un método de diagnóstico efectivo, rápido y económico que permita un uso amplio; segundo, la obtención de una vacuna eficaz contra distintas variantes del virus que circulan normalmente y, tercero, un programa de vigilancia epizootiológica, serológica y molecular que permita la actualización tanto del diagnóstico como de la vacuna. Estos puntos van a contribuir de forma importante en el control y la eliminación del RVP en granjas porcícolas en México y con ello enfocar esfuerzos hacia otras afecciones importantes en cerdos.

Resumen

El Rubulavirus porcino (RVP), que pertenece a la familia Paramyxoviridae, causa la enfermedad del ojo azul en los cerdos, caracterizada por encefalitis y falla reproductiva en cerdos recién nacidos y adultos, respectivamente. No existe un tratamiento eficaz contra el RVP y tampoco hay información sobre la eficacia de las vacunas disponibles. En México se han producido continuos brotes desde principios de la década de los 80, que han causado grandes pérdidas económicas a los productores de cerdos. La vacunación se puede utilizar para controlar esta enfermedad. En este estudio se describe el análisis inmunoinformático de la proteínas F y HN de RVP y la expresión de la proteína F en Pichia pastoris. Buscando candidatos a antígenos efectivos contra RVP, primero se secuenció el gen de la proteína F de RVP cepa PAC1, luego usamos varias herramientas inmunoinformáticas para predecir determinantes antigénicos de células B y células T contra las glicoproteínas del virus (proteínas HN y F). Finalmente, realizamos un acoplamiento con AutoDock Vina para determinar las energías de enlace. Obtuvimos la secuencia del gen F de una cepa de RVP recolectada a principios de la década de 1990 en México y comparamos su perfil de aminoácidos con cepas anteriores y recientes, obteniendo una identidad de 97.78 a 99.26%. Para las proteínas F, se predijeron siete epítopos lineales de células B, seis epítopos conformacionales de células B y veintinueve epítopos de MHC de clase I de células T. Para las proteínas HN, se predijeron dieciséis epítopos lineales de células B, siete epítopos conformacionales de células B y 34 epítopos de MHC de clase I de células T. Los epítopos NRTYGPPAYVPPDNIIQS y AQATAAVAL presentes en la proteína F pudieran ser importante porque son reconocidos tanto por células B, como células T. Se determinó la energía de unión in silico entre los epítopos predichos en las proteínas F y HN y las moléculas de MHC-I de cerdo. Los rangos de energía de unión para estos epítopos oscilaron entre -5,8 y -7,8 kcal / mol. La segunda parte del estudio fue generar cepas de Pichia pastoris que expresan la proteína F. El marco de lectura abierto (ORF) de la proteína F se amplificó a partir de la cepa PAC1 de RVP por RT-PCR, luego las regiones F1 y F2-F1 se clonaron en el vector de expresión pPICZαB generando dos construcciones pPICZ-eF1 y pPICZ-F2-1. Los vectores se integraron en el cromosoma de levadura, ambas células transformantes presentan un fenotipo Mut +. Las cepas se denominaron X-33-eF1 + y X-33-eF2-1 +. Las proteínas eF1 y eF2-1 se recuperaron del medio libre de células después de seis días. Ambas proteínas fueron reconocidas por el suero de cerdos infectados con diferentes cepas mediante Western blot. La proteína eF1 se purificó mediante cromatografía de afinidad de metales inmovilizados (IMAC), recuperando 125 µg / 100 ml. El presente estudio tuvo como objetivo evaluar el uso de la proteína F como antígeno que podría activar diferentes respuestas del sistema inmunológico. La proteína eF1 podría ser un candidato para ser propuesto para una vacuna o para usar como antígeno en una prueba serológica, esto debido a que fue reconocida por sueros de cerdos infectados por diferentes cepas de RVP lo que sugiere que los determinantes antigénicos se mantienen independiente de la cepa de RVP, sin embargo, se deben realizar más análisis para asegurar esto.

Para acceder a la tesis completa publicada en el Repositorio Institucional digital de la Benemérita Universidad Autonóma de Puebla haga CLICK en: "Producción, purificación y valoración antigénica de la proteína de fusión (f) del rubulavirus porcino, expresada en la levadura pichia pastoris”

El autor participó en varios congreso, como el LII Congreso nacional AMVEC (México.Julio de 2018) con la presentación junto a otros autores del cartel: Obtención de una Cepa P. Pastoris, productora de F1 de la proteina F de rubulavirus porcino: y el XI Congreso Nacional de Virología (México. Septiembre de 2019) con la expsición del trabajo libre: Expresión y purificación del ectodomio de la proteina de fusión de una paramixovirus en la levadura pichia pastoris