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Implementación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como método de detección de Streptococcus agalactiae en muestras de leche bovina en Antioquia, Colombia

Publicado: 21 de abril de 2016
Por: Ximena Cardona1,3, A. López2,3 y J. Echeverri2,3 1 Cooperativa Lechera COLANTA Ltda., 2 Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Colombia, Sede Medellín, 3 Grupo de Investigación BIOGEM, Biodiversidad y Génetica Molecular
Resumen

La mastitis bovina se define como la inflamación de la glándula mamaria, caracterizada por cambios en el tejido y cambios físicos y químicos de la leche (Ballou, 2011). El S. agalactiae es conocido como el agente etiológico por excelencia de la mastitis clínica y subclínica en los bovinos (Dmitriew et al, 2002). La prueba California Mastitis Test (CMT) es el método tradicional para detectar infecciones de la glándula mamaria bovina en condiciones de campo, esta no determina el agente etiológico. Una opción para hacerlo es el cultivo in vitro, sin embargo el objetivo de esta investigación es implementar la técnica molecular Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), como un método de identificación rápido, y con la ventaja de ser muy específica y sensible, no necesita etapa de cultivo y pueden discriminar entre organismos estrechamente relacionados (Riffon et al, 2001). Se analizaron 12 muestras de
leche provenientes de cuartos de hembras bovinas diagnosticados por la prueba CMT con mastitis clínica y subclínica grado 3. Se estandarizaron las técnicas de biología molecular como la extracción de ADN bacteriano a partir de leche y la PCR, obteniéndose un fragmento de 586 pb del gen 16S rRNA en las muestra positivas para la presencia de S. agalactiae. Se concluye que la técnica puede ser utilizada como alternativa para el diagnostico de tan importante enfermedad con ventajas importantes sobre las tradicionales.

Palabras clave: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR), mastitis, vacas de leche, diagnóstico molecular.

Introducción
La mastitis bovina es la inflamación del parénquima de la glándula mamaria, caracterizada por cambios del tejido, y cambios físicos y químicos de la leche, donde los más importantes son hinchazón, temperatura elevada, dolor y endurecimiento de la glándula mamaria, y en el caso de la leche, decoloración, presencia de coágulos y presencia de un alto número de leucocitos (Ballou, 2011). Es causada por diferentes agentes infecciosos, que entran en el ambiente estéril de la glándula mamaria como resultado de la interrupción de barreras físicas tales como el pezón, requiriendo las defensas del huésped prontas y apropiadas para prevenir la colonización y la patología de la enfermedad posterior. Estos agentes infecciosos comúnmente están divididos en los agentes contagiosos de mastitis que se propagan de un cuarto de la ubre infectado a otro cuarto y entre vacas y los agentes ambientales los cuales están presentes usualmente en el medio y pueden llegar a colonizar la ubre (Zadoks, 2014). 
Es una enfermedad costosa y compleja de origen y gravedad variable, resultado del entorno, el patógeno y el estatus inmunitario de la vaca (DeVliegher et al, 2012). El Streptococcus agalactiae es conocido como el agente etiológico por excelencia de la mastitis clínica y subclínica en los bovinos (Dmitriew et al, 2002). Es altamente contagioso entre las vacas, diseminándose principalmente durante el ordeño, ya que puede sobrevivir por periodos cortos en las manos del ordeñador, equipos de ordeño y otros instrumentos (por ejemplo, en las toallas para lavado y secado). Después de su transmisión, coloniza la piel del pezón y logra el acceso a la ubre a través del esfínter donde es capaz de crecer y multiplicarse (Keefe & Chaffer, 2010). La infección con este patógeno tiene un impacto significativo en la calidad de la leche, causando una de las mayores elevaciones en el RCS comparado con otros patógenos (Keefe & Chaffer, 2010).
Hay amplias gamas de los procedimientos para diagnosticar la mastitis con diferentes principios de acción, donde algunos de ellos se basan en detección de anomalías de la ubre y la leche tales como cambios del color de la leche, aparición de grumos, coágulos sanguinolentos, coágulos con pus, o una leche más acuosa (Pérez et al, 2005); y marcadores de inflamación que incluyen el examen físico y clínico de la ubre, el recuento de células somáticas, el California Mastitis Test (CMT), la prueba de conductividad eléctrica, el medidor de pH, la prueba de NaOH y la medición de D - glucosaminidasa N-acetil-b (NAG-asa), y la lactatodeshidrogenasa (LDH). Otros tipos de diagnóstico más específicos, son los basados  principalmente en el aislamiento y la identificación del patógeno causante de mastitis, como es el cultivo bacteriológico de leche, las pruebas bioquímicas y la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR); o la respuesta inmune (anticuerpos) como es el Elisa.
Las pruebas diseñadas para la identificación de un (os) patógeno (s) en cualquier enfermedad infecciosa, y por ende en infecciones de la glándula mamaria, es el cultivo in vitro de la leche, considerada la prueba “gold standard”, técnica compleja, ya que demanda 1) tiempo: lento crecimiento del organismo (en algunos casos, hasta 14 días para obtener colonias visibles), 2) medios de cultivo y condiciones de incubación especializados, y 3) pruebas adicionales (bioquímicas) para identificación (Khodakaram-Tafti y López, 2004). La técnica molecular Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR, Polymerase Chain Reaction, por sus siglas en inglés) se basa en la detección y amplificación de secuencias especificas en el genoma de cualquier organismo basada en la detección de ácidos nucleicos de patógenos, es un método de identificación rápido (horas o máximo 1 o 2 días), y en particular tiene la ventaja de ser muy específica y sensible, no necesita etapa de cultivo y pueden discriminar entre organismos estrechamente relacionados, tales como Streptococcus parauberis y Streptococcus uberis, lo cual no es posible por el método bacteriológico tradicional (Riffon et al, 2001). El objetivo de esta investigación es estandarizar la técnica de extracción de DNA y detección de Streptococcus agalactiae en leche de bovinos en Antioquia 
 
Materiales y Métodos
Para la estandarización de las técnicas de biología molecular se colectaron 12 muestras de leche cruda de cuartos con mastitis clínica de hembras bovinas de hatos lecheros. El ADN bacteriano se extrajo mediante dos metodologías. La primera mediante Fenol- Cloroformo, descrita por Potou en 2005, con modificaciones, así: se tomó 1.5 mL de cada muestra de leche en tubos eppendorf y se centrifugó a 12.000 RPM (Revoluciones Por Minuto) por 5 minutos para descartar agua y grasa. Se adicionó 500 μL de buffer TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA), 30 μL de SDS 20 % y 30 μL de proteinasa K (20 mg/mL) (Invitrogen), y se incubó durante 1 hora a 37 º C. Pasado este tiempo, las muestras se agitaron con vortex y se adicionó un volumen igual de Fenol-Cloroformo-Isoamilico (25:24:1). Por agitación, se formó una emulsión, se centrifugó a 13.000 RPM durante 5 minutos a temperatura ambiente y se transfirió la fase superior acuosa a un nuevo vial. Se adicionó un volumen igual de Fenol- Cloroformo-Isoamilico (25:24:1), se mezcló por inmersión hasta que las fases se entremezclaran y se centrifugó a 13.000 RPM por 3 minutos. Se trasfirió la fase superior a nuevo vial de 1.5 mL y se adicionó 1/10 de volumen de acetato de sodio 2M y un volumen de etanol absoluto a – 20 º C. Se realizó la mezcla por inversión de los componentes y nuevamente se centrifugó a 13.000 RPM durante 5 minutos y posteriormente se descartó el sobrenadante. El botón de ADN se lavó con 500 μL de etanol al 70% y se resuspendió en 100 μL de buffer TE 1X y se almacenó a – 20 º C para su posterior uso. El segundo método consistió en la extracción de ADN con el kit DNeasy blood and tissue Qiagen®, de acuerdo a las recomendaciones realizadas por la casa fabricante (Qiagen, 2006). Con la primera metodología se extrajo el ADN de 6 muestras de leche y con la segunda metodología las 6 muestras restantes.
Mediante la técnica de PCR se amplificó un fragmento de 586 pb del gen 16S rRNA de Streptococcus agalactiae. Los primers utilizados tienen la siguiente secuencia de nucleótidos: F -5´- CGT TGG TAG GAG TGG AAA AT - 3'; R - 5' - CTG CTC CGA AGA GAA AGC CT- 3' (Riffon et al contenía: 200 nanogramos de ADN; Buffer 10X; MgCL2 25 mM; dNTPS 200 mM, 0.5 μM de primers y 5 U de Taq ADN polimerasa (Fermentas). La PCR se corrió en un termociclador Bio-Rad Termal cycler C1000®, con el siguiente perfil térmico: un ciclo inicial de desnaturalización de 94 º C por 2 minutos, 35 ciclos en las siguientes condiciones: 94 º C por 45 segundos para desnaturalización, 65 º C por 1 minuto para anneling y 72 º C por 2 minutos para extensión. Un ciclo final de extensión a 72 º C durante 10 minutos. Toda PCR implicó la amplificación del fragmento de 586 pb del gen 16s rRNA en el control positivo: ADN de la cepa ATCC 13813 (American Type Cultive Collection) y la ausencia de amplificación del fragmento en el control negativo que consistió en una mezcla de reacción donde se reemplazó el ADN por agua.
 
Resultados
Evaluación de la eficiencia de las dos metodologías de extracción de ADN. Se realizó la cuantificación por espectrofotometría de 8 ADN obtenidos por ambos métodos de extracción (Fenol: Cloroformo y Kit) tomados al azar. Los resultados se observan en la tabla 1. El protocolo de extracción por kit permitió conseguir ADN de mejor calidad con bajos contaminantes, donde los valores de absorbancia a 260/280 nm mostraron la inexistencia de proteínas en exceso, con respecto al protocolo fenol: cloroformo. Sin embargo, la concentración media de ADN extraída de muestras de leche utilizando el protocolo fenol: cloroformo, fue de 1583,2 ng/μL y utilizando el protocolo de extracción de ADN por kit, la concentración media fue de 11,4 ng/μL.
Estandarización de la PCR para el diagnóstico de la presencia de Streptococcus agalactiae. Mediante PCR se obtuvo un amplificado 586 pb correspondiente a un fragmento del gen 16S rRNA en 8 de un total de 12 ADN, los cuales se diagnosticaron como positivos para la presencia de S. agalactiae. Entre tanto, las muestras restantes (4) que no presentaron el amplificado, se diagnosticaron como negativas para S. agalactiae. En la figura 1 se presenta
la electroforesis con los productos de la PCR para el diagnóstico de S. agalactiae.
Implementación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como método de detección de Streptococcus agalactiae en muestras de leche bovina en Antioquia, Colombia - Image 1
Implementación de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) como método de detección de Streptococcus agalactiae en muestras de leche bovina en Antioquia, Colombia - Image 2
Figura 1. Electroforesis en gel de agarosa al 2 % con los productos de la PCR para el diagnóstico de S. agalactiae de 9 muestras de leche provenientes de cuartos de hembras bovinas con mastitis clínica. De izquierda a derecha: carril 1: Marcador de peso molecular GeneRuler Low Range DNA Ladder 50 pb (Thermo Scientific). Carril 2: control positivo (ADN cepa ATCC 13813). Carril 3: control negativo. Carril 4 al 13: muestras del estudio.
Las muestras del carril 4 y 13 no presentaron amplificado (negativas para S. agalactiae), las muestras de los otros carriles presentan el amplificado de 586 pb, fragmento gen 16S rRNA (positivas para S. agalactiae).
En cuanto a la estandarización de la técnica PCR para el diagnóstico de Streptococcus agalactiae, se obtuvo la amplificación de un fragmento de 586 pb del gen 16S rRNA en el control positivo (ADN de cepa pura de S. agalactiae ATCC 13813) y en 8 muestras de leche, lo que indica que las secuencias de los primers elegidos, la temperatura de hibridación y las concentraciones de los reactivos, son correctos. Nuestros resultados concuerdan con los reportados por varios autores. Riffon y colaboradores en 2001, probaron la PCR para la detección de los principales agentes infecciosos causantes de mastitis bovina: Escherichia  coli, Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus parauberis y Streptococcus uberis, utilizado para su estudio cepas puras ATCC y tres aislamientos de muestras de leche de casos clínicos de mastitis bovina. 
 
Referencias
Ballou, M.A. 2011. Inflammation: role in the etiology and pathophysiology of clinical mastitis in dairy cows. J Anim Sci 90: 1466–78.
DeVliegher, S., Fox L.K, Piepers S., McDougall S., Barkema H.W. 2012. Invited review: mastitis in dairy heifers: nature of the disease, potentiall impact, prevention, and control. J Dairy Sci 95:1025 - 40
Dmitriev A, Shakleina E, Tkacikova M, Mikula I y Totolian A. 2002. Genetic heterogeneity of the pathogenic potentials of human and bovine group B streptococci. Folia Microbiol. 47: 291 – 295.
Keefe G y Chaffer M. 2010. Mastitis: su efecto en la calidad de la leche y plan de control. CONGRESO: VII Seminario Internacional en Competitividad en Carne y Leche. 59 – 62 P.
Khodakaram-Tafti A. y Lopez A. 2004. Immunohistopathological findings in the lungs of calves naturally infected with Mycoplasma bovis. J Vet Med A Physiol Pathol Clin Med. 51:10–14.
Pérez, C.G., Bedolla, C.C., Castañeda, V.H. 2005. Importancia del conteo de células somáticas en la cría sustentable de vacas productoras de leche. Sustentabilidad. Universidad de Guadalajara, Jalisco México., 3(1):86-94.
Poutou R, Burbano M, Sierra S, Torres K, Carrascal AK y Mercado M. 2005. Estandarización de la extracción de ADN y validación de la PCR múltiple para detectar listeria monocytogenes en queso, leche, carne de res y pollo. Revista de la Facultad de Ciencias, Universidad Pontificia Javeriana. 10 (2): 61 - 78. 
Riffon R, Sayasith K, Khalil H, Dubreuil P, Drolet M. y Lagace J. 2001. Development of a rapid and sensitive test for identification of major pathogens in bovine mastitis by PCR. Journal of Clinical Microbiology. 2584 – 2589. 
Zadoks, R. 2014. Understanding the sources, transmission routes and prognoses for mastitis pathogens. WCDS Adv Dairy Technol 26: 91–100.
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Autores:
Albeiro López Herrera
Universidad Nacional De Colombia (UNAL)
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