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Colombia - Farvet presente en PANVET 2012

Publicado: 13 de noviembre de 2012
Fuente: Farvet
Farvet estuvo presente en el "XIII Congreso Panamericano de Ciencias Veterinarias (PANVET 2012)" del 24 al 27 Octubre del 2012, Cartagena de Indias, Colombia donde tuvo activa participación con la presentación de tres trabajos de investigación,  que fueran aprobados por la comisión organizadora y expuestos, a cargo del personal del Laboratorio de Biología Molecular y Genómica.

Los temas fueron:
  1. Detection and identification of chicken DNA viruses using Multiplex Real-Time TaqMan PCR. Sandra Morales, Jorge Bendezú, Luis Tataje, David Requena, Manolo Fernández. 
  2. Presencia de las especies C, D y E de Fowl Adenovirus (FAdV) en el Perú identificadas por PCR-RFLP y filogenias moleculares durante el periodo 2009-2011. Ana Chumbe.
  3. - Expresión soluble de la glicoproteína Espícula del virus de bronquitis infecciosa aviar usando al sistema de expresión de Baculovirus. Ray Izquierdo.

Adjuntamos los resúmenes de los trabajos:  

Detección e Identificación de virus ADN que infectan pollos utilizando
Multiplex TaqMan en PCR tiempo real
Sandra Morales, Jorge Bendezú, Luis Tataje, David Requena, Manolo Fernández.  
Introducción: La producción avícola viene siendo afectada por la presencia de enfermedades virales que causan pérdidas económicas. Por lo que el desarrollo de técnicas que permitan una rápida detección e identificación de estos virus ADN en pollos es importante para prevenir la dispersión de estos. Real-Time PCR permite detectar y cuantificar moléculas de ADN. El uso de sondas TaqMan en PCR en tiempo real incrementan la sensibilidad de la amplificación de ADN, permitiendo un mejor y exacto diagnostico que el PCR en tiempo real basado en Sybr Green. Un multiplex TaqMan PCR en tiempo real fue desarrollado y esto permitió un rápido análisis e identificación de múltiples virus ADN.
Metodología: En este estudio 5 virus que afectan pollos fueron divididos en dos multiplex sets. Cada Multiplex set (MS) incluían primers y sondas específicos para la amplificación y detección de secuencias especificas de virus. MS-I detectó: MDV (MV094), EDS (ORF 1-hp) y FPV (4b); mientras MS-II: CAV (Vp 2), HVT (gp I) (Vacunas) y ILTV (gp B). Estas secuencias fueron determinadas por comparación genómica utilizando la base de datos de GenBank y los sets de multiplex fueron diseñados utilizando los programas PrimerBlast, NetPrimer y AlleleID. Los productos amplificados de PCR fueron secuenciados para verificar la correcta identidad de los productos de PCR.
Resultados: Para evaluar la sensibilidad y cuantificar los ADN blancos, los productos de PCR fueron clonados y luego diluidos en series de 10. La menor detección para la reacción de múltiplex fue: para MS-I: MDV (84.5 genomas), FPV (4.9 genomas) y EDS (43.95 genomas). Y para MS- II: CAV (630 genomas), ILTV (10 genomas) y HVT (8.75 genomas).
Con el objetivo de validar cada set de multiplex, la sensibilidad (S) y especificidad (Sp)  fueron calculadas utilizando muestras de ADN extraídas y analizadas durante los años 2008 – 2012 utilizando PCR en tiempo real con SybrGreen. 107 muestras fueron analizadas para MS-I. La S y Sp fueron 94.32% y 92.10% respectivamente. Para MS-II, 82 muestras fueron evaluadas. La S y Sp fueron 85.37% and 97.56% respectivamente.
Conclusión: Este estudio demuestra la aplicación de Multiplex TaqMan en PCR tiempo real como una herramienta útil - eficaz para la detección rápida y simultánea de diferentes tipos de virus de ADN en pollos infectados.

 Presencia de las especies C, D y E de Fowl Adenovirus (FAdV) en el Perú identificadas por PCR-RFLP y filogenias moleculares durante el periodo 2009-2011. 
Ana Chumbe M.¹ *, Luis Tataje L.¹, Ray Izquierdo L.¹, IvanBest C.¹, Luis Saravia C.¹, Milagros Zavaleta¹,Manolo Fernández D.¹
¹Laboratorio de Biotecnología Molecular y Genómica – FARVET. Chincha-Perú
INTRODUCCIÓN
El género Aviadenovirus (FAdV) ha sido dividido en 5 especies en base a estudios a nivel molecular y subdividido en base a ensayos de neutralización cruzada en 12 serotipos (1 al 7, 8a, 8b y del 9 al 11) según el comité Internacional de taxonomía de virus (ICTV).

Los adenovirus son ubicuos en los pollos y han sido aislados en aves clínicamente enfermas y sanas. Sin embargo, puede ser el responsable de considerables perdidas económicas, con una mortalidad de hasta el 80% en caso de presentarse Síndrome de Hidropericardio (SHP) y hasta 30% en caso de Hepatitis a cuerpos de Inclusión (HCI), según la organización mundial de sanidad animal  (OIE).

En el Perú, durante los años 2009-2010, FAdV ocasionó pérdidas mínimas en la industria avícola; sin embargo, en el 2011 se dieron diversos brotes de HCI y/o SHP con tasas de mortalidad de hasta 50% en diferentes zonas del Perú. En los casos más severos las vacunas utilizadas, si bien protegían, no eran del todo efectivas, lo que hizo sospechar que podrían existir más de una especie de FAdV involucrada.

Con la finalidad de determinar las especies de FAdV presentes en el Perú, se implemento el método desarrollado por Meulemans G., et al 2001 que identifica serotipos de FAdV por medio de la técnica de PCR-RFLP para la región del loop L1 del hexon. En los casos en los que el PCR-RFLP no fue concluyente, se realizó un árbol filogenético basado en la secuencia nucleotídica de esta misma región.
 
METODOLOGÍA
Se evaluaron 20 biopsias de granjas que presentaban síntomas de HCI y/o SHP:2 muestras del 2009, 2 muestras del 2010 y 16 muestras del 2011 de diferentes zonas del Perú.
RESULTADOS
CONCLUSIONES
En base al árbol filogenético, se encontró a dos muestras incluidas en el cluster del serotipo 8a, que corresponde a la especie E. Otra muestra cercanamente relacionada al cluster del serotipo 11 (Especie D). Las restantes 17 muestras correspondieron al serotipo 4 (Especie C), según los análisis de PCR-RFLP. El hallazgo de las especies D y E, únicamente en el 2011 indica que estas han sido introducidas al Perú recientemente.
El método de PCR-RFLP propuesto por Meulemans G. et al., 2001 si bien logró asignar serotipos en el 85% de los casos, no fue del todo efectivo.
Probablemente, son necesarias analizar mutaciones puntuales (detectables únicamente por secuenciamiento) para poder conocer claramente la especie de FadV involucrada.
La identificación de los serotipos circulantes sirve de base para replantear los planes de vacunación y producir vacunas que controlen oportunamente el SHP y HCI.
 
REFERENCIAS
Meulemans G., Boschmans M., Van den Berg T.P, & Decaesstecker M., 2001. Polymerase chain reaction combined with restriction enzyme analysis for detection and differentiation of fowl adenovirus. Avian Pathology. 30,655-660.

Expresión soluble de la glicoproteína Espícula del virus de bronquitis infecciosa aviar usando el sistema de expresión de Baculovirus
Ray Izquierdo L.1*, Ana Chumbe M.1, Luis Tataje L.1, Vikram Vakharia2, Manolo Fernández S.1
1Laboratorio de Biotecnología Molecular y Genómica – FARVET SPF
2Department of Marine Biotechnology – University of Maryland
Resumen
Antecedentes: Las vacunas producidas en huevo contra la bronquitis infecciosa aviar (BIA) no son siempre efectivas y causan efectos indeseados dentro de poblaciones de aves vacunadas, por lo que surgen como alternativa las vacunas basadas en proteínas recombinantes. La glicoproteína espícula (S) ha sido reportada como una de las proteínas más protectivas contra bronquitis. Nativamente, S es homotrimérica y su dominio extracelular se compone de dos subdominios (S1 y S2) que probablemente contienen epítopes, que estimulen efectivamente el sistema inmune del ave.
Objetivo: Expresar solublemente el dominio extracelular completo de la glicoproteína S de bronquitis, para posteriormente usarla como vacuna y para diagnóstico.
Metodología: Usando el sistema de expresión de baculovirus hemos generado una glicoproteína S soluble, derivada de la cepa Mass41 de bronquitis, modificada en el C-terminal con la secuencia de trimerización (“foldon”) de la fibritina proveniente del bacteriófago T4 para estabilizar la triple hélice. Para lograr esto, se amplificó por PCR el dominio extracelular de S. Los primers forward y reverse contenían en sus extremos 5´sitios de restricción para BamHI y NheI, respectivamente, para ser clonado en un pAcGP67A (BD Bioscience), provisto por el Dr. Vikram Vakharia, el cual contenía el sitio de corte de la trombina, el “foldon” y 6x His-tag en su extremo 3´. La transfección y obtención de baculovirus recombinante fue realizada según instrucciones del fabricante. Grandes stocks de virus fueron obtenidos inoculando células SF9 en medio suplementado con SFB en 50% de confluencia y un MOI (multiplicidad de infección) menor a 0.2 por cuatro días, luego se concentró el virus del sobrenadante por ultracentrifugación y el pellet fue resuspendido en PBS. La expresión soluble de la proteína se realizó en medio libre de suero y fue comprobada por Western Blot.
Resultados: la expresión de S en medio libre de suero fue exitosamente identificada por una reacción positiva al cromógeno HRP de un anticuerpo monoclonal anti His-tag y a suero de pollo específico anti-bronquitis, que se visualizó como una banda de alrededor de 180kDa.
Conclusiones: En trabajos anteriores se ha expresado S1, sin embargo este es el primer estudio donde se expresan ambos subdominios extracelulares (S1 y S2) lo que puede extrapolarse para cepas altamente virulentas. Estudios recientes en influenza, VIH y otros virus muestran que muchas veces mantener la conformación tridimensional de las proteínas confiere alta protección inmunológica, lo que podrá ser probado para bronquitis a partir de este trabajo.
Fuente
Farvet
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Danilo Jose Agudelo
22 de diciembre de 2012
muy interesante ,esta investigacion quisiera me comentaran los autores, si el hidropericardio, causado por los virus, pueda tener correlacion con la ascitis hipoxica o edema aviar, muchas gracias, Danilo Agudelo
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