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Rastreabilidade da salmonella do crescimento ao abate de suínos |
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Autor: Kich, J.D. ; Coldebella, A.; y Mores, N. (Embrapa- Suínos e Aves. Brasil); e Fratamico, P.M ; Call J.E.; Luchansky, J.B. (Eastern Regional Research Center -ARS-USDA, USA)
A Salmonella é uma das principais causas de doenças transmitidas por alimentos (DTAs) e os animais
de produção são considerados seu maior reservatório. Os suínos foram indicados como fonte primária de
salmonelose humana em 15% dos casos na Dinamarca3 e Holanda2 e em 25% nos USA1. A entrada
sistemática de animais portadores e excretores de Salmonella nas plantas frigoríficas é a maior causa de
contaminação dos produtos cárneos. As boas práticas de produção diminuem os riscos de contaminação
cruzada durante o abate e processamento, mas o primeiro ponto crítico de controle são os próprios suínos. A
variabilidade de isolados de Salmonella presentes nas granjas e as múltiplas possibilidades de portadores e
vetores dificultam o relacionamento epidemiológico entre a contaminação do produto e suas fontes de
infecção ao longo da cadeia produtiva. Entre as ferramentas disponíveis para genotipificação e discriminação
de amostras de Salmonella, a eletroforese em campo pulsado (PFGE) é a eleita como rotina nas
investigações de surtos humanos6 e usada em estudos epidemiológicos na produção animal8,9. O objetivo
deste trabalho foi relacionar epidemiologicamente, por meio da PFGE, isolados de Salmonella provenientes
do ambiente de granja, dos animais excretores, da ração e das baias de espera no abatedouro com os
isolados de linfonodos mesentéricos e superfície das carcaças de suínos de 12 granjas de terminação do
oeste de Santa Catarina.
MATERIAIS E MÉTODOS
O estudo foi conduzido em 12 granjas de crescimento e terminação que alojavam entre 250 e 800
suínos cada uma.
Amostragem: para estimar a prevalência, o n° de animais amostrados considerou o tamanho do lote,
prevalência estimada de 50%, nível de confiança de 95% e acurácia de 15%, sendo amostrados, em média,
23 leitões/lote.
Coleta no dia do alojamento: antes do alojamento foram realizados cinco suabes de arrasto nas
baias para avaliar a contaminação residual por Salmonella. Assim que os leitões desembarcavam foram
coletadas amostras de fezes (na quantidade mínima de 25g) de 10 animais individuais e mais 5 pools de 5
animais para pesquisa de Salmonella.
Coleta de ração: foram amostradas todas as partidas de ração que chegaram na granja durante o
crescimento e terminação do lote.
Coleta de material no pré-abate: no dia do carregamento para o abate, os suínos foram tatuados e
sangrados na granja. Foram realizados três suabes de arrasto na baia de espera imediatamente antes dos
animais serem descarregados no abatedouro.
Coleta de material no abatedouro: os suínos tatuados na granja foram acompanhados ao abate
onde coletou-se os linfonodos mesentéricos (LM). No outro dia, após a refrigeração, cada carcaça foi
amostrada com três suabes de 100cm² na região do esterno, papada e pernil próximo a cauda, os quais
foram processados conjuntamente para pesquisa de Salmonella. Foi realizado uma sub-amostragem de 100
carcaças, das quais foram coletados linfonodos inguinais e pré-escapulares e suabes da superfície, como já
descrito, antes da refrigeração.
Pesquisa bacteriológica de Salmonella: seguiu a metodologia descrita anteriormente7. A
sorotipificação dos isolados de Salmonella foi realizada no Instituto Osvaldo Cruz.
PFGE: 1281 isolados foram submetidos ao protocolo de PFGE para os sorovares não tifóides de
Salmonella preconizado pelo Pulse Net (CDC, Atlanta GA). O DNA foi cortado com a enzima XbaI em plugs
com 2% de agarose, a eletroforese foi realizada no sistema CHEFmapper XA (Bio-Rad) nas seguintes
condições: baixa MW= 30Kb e alta MW=700 Kb; tempo inicial=2,12s; tempo final=63,8s; gradiente= 6-V/cm;
ângulo=120°; corrida em tampão 0,5X tris borato EDTA acrescido de 50μM de tiuréia por 18horas a 14°C. Os
géis foram corados com brometo de etídio, as imagens foram digitalizadas (TIFF) sob iluminação ultra violeta
e documentadas pelo programa Multi-Analist (Bio-Rad). O perfil de restrição, agrupamentos e dendogramas
foram analisados pelo programa BioNumerics por meio da correlação de Dice com uma tolerância de 1,7% na
posição das bandas5. A genotipificação foi realizada no ERRC-ARS-USDA, Wyndmoor/PA-USA em
colaboração com a Embrapa Suínos e Aves.
Análise estatística: foram utilizados recursos do SPADN10 para realização da análise de
correspondência múltipla (ACM), no intuito de associar a ocorrência dos grupos (pulsotipos) de Salmonella
nos diferentes locais de amostragem de cada rebanho.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi possível realizar a genotipificação de 1.071 isolados de Salmonella provenientes de 1258
amostras. Desconsiderando os isolados repetidos na mesma amostra permaneceram 747 isolados
distribuídos em 163 diferentes perfis de restrição (pulsotipos). O maior número de isolados é proveniente dos
LM, porém a maior variabilidade entre pulsotipos foi observada nas amostras de ambiente de granja (piso das
baias) e baia de espera do frigorífico. Dos 163 pulsotipos, 93 foram observados apenas uma vez, seis
pulsotipos foram considerados muito freqüentes ocorrendo em 33 isolados ou mais. O pulsotipo mais
freqüente ocorreu em 136 isolados e estava amplamente distribuído em todos os tipos de amostras
estudadas.
Na Fig. 1 é apresentado o mapa da análise de correspondência múltipla entre os perfis. Observa-se
no lado direito do mapa, que a presença do pulsotipo na granja e nos excretores no alojamento está
relacionada com a presença do mesmo pulsotipo nos linfonodos inguinais e pré-escapulares. Esta relação
sugere o efeito do tempo, ou seja os pulsotipos que já infectavam os leitões no período de creche e início do
crescimento tiveram mais tempo para alcançar os linfonodos profundos. No lado esquerdo inferior do mapa,
observa-se a relação entre os pulsotipos da baia de espera com aqueles encontrados na carcaça antes e
depois da refrigeração. Esta relação é esperada uma vez que os animais entraram em contato com estes
pulsotipos, contaminaram-se e lavaram os mesmos para dentro do frigorífico. A baia de espera recebe
pulsotipos de todo sistema de produção e os animais se concentram neste local no pré-abate, tornando-se
um ponto crítico de contaminação.
Embora a ração possa ser uma fonte de infecção, a observação da Fig. 1 mostra que ela tem pouca
relação com a infecção de linfonodos e contaminação de carcaça nesse estudo. Embora tenha sido
observado o mesmo pulsotipo exclusivamente na ração e LM, isso ocorreu raramente e não aparece no
mapa (Fig.1). Isto pode ser explicado pelas múltiplas fontes de infecção e pela diversidade entre as amostras
de Salmonella que contaminam os LM e carcaças, a relação com a ração acaba sendo menor do que com as
demais fontes.
Nos 12 lotes estudados foram observados 73 pulsotipos diferentes de Salmonella nos LM. Foram
observadas, em diferentes ocasiões, o mesmo pulsotipo sendo excretado no alojamento, o que representa
contaminação na fase de creche, no ambiente da granja que representa contaminação residual ou
recontaminação após o vazio sanitário, na ração e baia de espera no frigorífico. A falta de maior relação com
uma fonte de infecção específica é ilustrada pela posição dos LM na Fig. 1, próxima a origem dos eixos do
mapa.
As contaminação da carcaça parece estar mais relacionadas com a dinâmica de contaminação do
dia de abate, que abrange mais possibilidades do que as fontes de infecção do lote amostrado
especificamente. Foi observado, em dois frigoríficos com prevalência de 26% e 70% de carcaças
contaminadas, que no primeiro 25% das carcaças possuíam amostras do próprio animal, 47% de suínos
abatidos anteriormente e 28% de amostras da planta (pessoal e equipamentos) e no segundo que 4% das
carcaças contaminadas possuíam amostras do próprio animal, 70% de suínos abatidos anteriormente e 26%
de planta. Este trabalho comprovou a diferença entre as plantas e que no segundo frigorífico a contaminação
cruzada foi mais importante do que no primeiro4.
CONCLUSÕES
Os leitões excretores no alojamento, o ambiente da granja e as baias de espera no frigorífico são as
principais fontes de infecção de Salmonella para linfonodos mesentéricos e contaminação da superfície de
carcaças de suínos na fase de crescimento e terminação.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Bean, N. H. and Griffin, P.M. Foodborne disease outbreaks in United states. 1973-87: Pathogens, vehicles
and trends. J. Food Protec., v.53, p.804-817, 1990.
2. Berends B. R. et al. Impact on human health of
Salmonella spp. on pork in The Netherlands and anticipated effects of some currently proposed control
strategies. Int. J. Food Microbiol., v.44, p. 219-229, 1998.
3. Borch, E., Nesbaskken, T, Christensen, H.
Hazard indentification in swine slaughter with respect to foodborne bacteria. Int. J. Food Microbiol., v.30, p. 9-
25, 1996.
4. Botteldoorn, N. et al. Phenotypic and molecular typing of Salmonella strains reveals different
contamination sources in two commercial pig slaughterhouses, Appl. and Environ. Microbiol., v.70, p.5305-
5314, 2004.
5.Carriço, J. A. et al. Assessment of band-based similarity coefficients for automatic type ans
subtype classification of microbial isolates analyzed by pulsed-field gel electrophoresis. J. Clin. Microbiol.
V.43, n.11, p.5483-5490, 2005.
6. Centre for Diseases Control and Prevention: www.cdc.gov/PULSENET.
7.
Michael,G. B. Comparision of different seletive enrichment steps to isolate Salmonella sp. from feces of
finishing swine. Braz. J. Microbiol., v. 34, p.138-142, 2003.
8. Refsum T., et al. Molecular epidemiology of
Salmonella enterica serovar Typhimurium isolates determined by pulsed-field gel electrophoresis:
comparasion of isolates from avian wildlife, domestic animals, and the environment in Norway. App. Environ.
Microbiol., v.68, n.11, p5600-5606, 2002.
9. Sandvang, D. et al. Persistence of a Salmonella enterica serotype
Typhimurium clone in Danish pig production units and farmhouse environmet studied by pulsed-field gel
electrophoresis (PFGE). Microbiol. Letters, v.187, p.21-25, 2000.
10. SPADN- site SPAD version 3.7 (1998)
click aqui para ampliar a imagem
Figura 1. Mapa dos perfis de PFGE pela análise de correspondência multipla.
Artigo apresentado durante o XIII Congresso Brasileiro de Veterinários Especialistas em Suínos
Autor: Kich, J.D. ; Coldebella, A.; y Mores, N. (Embrapa- Suínos e Aves. Brasil); e Fratamico, P.M ; Call J.E.; Luchansky, J.B. (Eastern Regional Research Center -ARS-USDA, USA)
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ENGORPART POR 20080513
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