El objetivo del presente trabajo fue evaluar la inmunogenicidad de dos vacunas experimentales inactivadas para RVE, elaboradas por el Laboratorio Santa Elena. Se estudió la respuesta humoral en 15 equinos criollos luego de la inmunización. Los anticuerpos neutralizantes anti-EHV fueron cuantificados los días 0, 20, 34, 113, 154 y 360 postvacunación.

La respuesta humoral no presentó diferencias significativas entre las formulaciones evaluadas. El pico máximo de anticuerpos neutralizantes fue encontrado al día 34, y luego una caída gradual hasta el final de la prueba. Los resultados concuerdan con los reportados por otros autores para vacunas comerciales inactivadas.

Introducción

La infección con Herpesvirus equino (HVE) tipo 1 y 4 ocasiona la Rinoneumonitis Viral Equina (RVE). Esta enfermedad se encuentra ampliamente distribuida en el mundo, y ocasiona pérdidas económicas por abortos, muertes perinatales, cuadros respiratorios y neurológicos (van Manen C. 2002). En Uruguay sólo se ha realizado el diagnóstico por histopatología, pero no hay aislamientos, ni datos de prevalencia serológica. La utilización de vacunas inactivadas asociadas a la bioseguridad para evitar la entrada, y/o difusión del EHV son las medidas de control más eficientes (Ostlund EN. 1993, Allen GP. 2002). La eficacia de las vacunas debe ser evaluada mediante pruebas de protección in vivo.

Debido a la complejidad y alto costo de estas pruebas, frecuentemente se utilizan sistemas que evalúan neutralización in vitro. La cuantificación de anticuerpos neutralizantes es una herramienta para evaluar inmunogenicidad de vacunas virales (Mumford EL. y col. 2003, Patel JR. y col. 2003, Heldens GM. Y col. 2001, Yasunaga S. y col. 2000, Ellis JA. y col. 1995). El principal rol de estos anticuerpos es neutralizar el virus en su fase extracelular, y de esta manera impedir la entrada a otras células, y disminuir la cantidad de virus excretado en las secreciones de animales infectados (Slater J. and Hannant D. 2000).

Materiales y Métodos

Animales para la prueba. Se utilizaron 15 equinos, de 5 a 8 años de edad, sin previa vacunación contra la enfermedad a estudio. Se dividieron al azar en tres grupos n=5. Grupo 1 = Vacuna 1, Grupo 2 = Vacuna 2 y Grupo 3 = equinos centinelas para evaluar la circulación del virus en el establecimiento al momento de la prueba.

Extracción de sangre.

Se obtuvieron por punción yugular muestras individuales los días: 0 ,20, 34, 113, 154 y 360 post primera dosis. Vacunas. Se inmunizó con dos formulaciones, utilizando un protocolo clásico (vacunación y revacunación a los 20 días). La dosis fue 2 ml. y la vía de administración intramuscular (i.m) en la tabla del cuello. Vacuna 1: Antígeno inactivado de EHV-1 en doble emulsión. Vacuna 2: Antígeno inactivado de EHV-1 en doble emulsión (fase oleosa), y toxoide tetánico adyuvado con fosfato de Al (fase acuosa).

Evaluación de anticuerpos neutralizantes específicos anti- EHV. Se utilizó la técnica de seroneutralización in vitro (S.N in vitro), según protocolo descrito en el Manual de standards para test diagnósticos y vacunas (OIE 2000). Diluciones crecientes de los sueros problema se incubaron con 100 unidades infectantes de la cepa de referencia EHV-1 Kentucky (ATCC) en placas de 96 pocillos. Se agregan células de riñón de conejo (RK13) y se mantuvo 7 días a 37ºC con 5% CO2. Se incluyen controles de crecimiento celular, titulación del virus, toxicidad de suero, y sueros de referencia anti-EHV (cedidos por Dr. G. Allen). El título de anticuerpo s se expresacomo el reciproco de la última dilución que protege del efecto citopático por EHV-1.

Análisis estadístico.

La media geométrica (mg) del título de anticuerpos fue calculada para cada grupo. Los datos fueron evaluados mediante la rutina XTGEE (ecuaciones de estimación generalizada) del software STATA v.8.2, tomando como variable de respuesta el logaritmo natural del título neutralizante.

Resultados
La media geométrica de los títulos de anticuerpos neutralizantes anti EHV en los grupos 1 y 2 aumentó notoriamente post vacunación. No se encontraron diferencias significativas entre las vacunas evaluadas (p = 0.486). La media geométrica del grupo 3 se mantuvo en los niveles iniciales durante la prueba (Gráfico 1). Los gráficos 2 y 3 muestran la respuesta individual en cada grupo de equinos vacunados.

Gráfico 1


Gráfico 2


Gráfico 3

Discusión

Los equinos centinela mantuvieron los titulos neutralizantes iniciales, lo cuál demuestra que no hubo circulación de EHV al momento de la prueba. Por lo tanto, la respuesta humoral observada en los grupos vacunados fue debida a la inmunogenicidad de las vacunas. En estos grupos los títulos neutralizantes se mantuvieron por encima de los iniciales durante un año. Títulos neutralizantes comparables a los encontrados para estas formulaciones, han demostrado ser eficaces para proteger del aborto, y disminuir la excreción de EHV y el cuadro clínico repiratorio en equinos (Heldens GM. y col. 2001).

La aplicación de estas pruebas para evaluar vacunas comerciales, asegura que cumplan con los standards internacionales, y garantiza al usuario un producto de calidad para ayudar al control de la RVE.

Agradecimientos

Dr. G. Allen (Universidad de Kentucky USA).
Dr. A. Leaníz (Campo Experimental Macondo).