Nuevos y viejos coronavirus: Sus manifestaciones clínicas y patológicas

Coronavirus son virus ARN, envueltos, de polaridad positiva, cadena simple; pertenecientes a la familia Coronaviridae y el orden Nidoviridales. Coronavirus, tiene el genoma más grande reconocido dentro de los virus ARN. Los grupos conocidos históricamente como grupos 1, 2 y 3 de coronavirus han sido designados como Alphacoronavirus, Betacoronavirus, y Gamacoronavirus respectivamente. En los últimos años, un nuevo grupo de coronavirus fue identificado en leopardo asiático y algunos tipos de aves. Así, se presentó un cuarto genero denominado deltacoronavirus. Cinco tipos distintos de coronavirus se han detectado en cerdos: virus de la diarrea epidémica porcina (PEDV), virus de gastroenteritis transmisible (TGEV), coronavirus respiratorio porcino (PRCV); todos pertenecientes al género Alphacoronavirus; virus de encefalomielitis hemaglutinante porcina (PHEV) en la familia Betacoronavirus, y Deltacoronavirus porcino (PDCoV) en el género Deltacoronavirus. 

PEDV es el agente causal de la diarrea epidémica porcina y fue descripto por primera vez en Inglaterra a comienzos de la década del 70. Su presentación clínica se caracterizó por diarrea acuosa, la cual no presento diferencias clínicas con la infección por TGEV. Los reportes describen que la única diferencia clínica aparente fue que este último virus afectaba mayormente a animales post destete mientras que esta nueva entidad afectaba a lechones lactantes. En 1978 un grupo de la Universidad de Ghent completo los postulados de Koch’s y describió el primer prototipo de PEDV (CV777), el cual era completamente distinto a los dos coronavirus porcinos que se conocían hasta el momento; TEGV y PHEV. Después de su primera descripción en Europa, los casos de PEDV solo se reportaban esporádicamente; ya para mediados de la década del 90 los casos de PEDV eran raros y solo se observaba ocasionalmente en animales adultos. Este nuevo virus se describió por primera vez en Asia en 1982, y desde su primera descripción se disemino ampliamente en toda Asia causando pérdidas económicas significativas. En octubre de 2010 un nuevo brote epizoótico de PEDV se reportó en China el cual afecto a cerdos de todas las edades, pero con más severidad a neonatos. A pesar de que PEDV estuvo circulando en China por más de 10 años, este nuevo brote fue causado por la cepa tradicional de PEDV y una nueva variable que difirió genéticamente de la cepa CV777. En abril de 2013 PEDV emergió en los Estados Unidos y se disemino rápidamente a todo el país, causando la muerte de más de 7 millones de cerdos durante su primer año y pérdidas económicas sustanciales. Los primeros brotes de PEDV en Estados Unidos se caracterizaron por diarrea acuosa, deshidratación y vomito variable con alta mortalidad en neonatos y alta morbilidad, pero baja mortalidad en animales pos destete. Análisis filogenéticos revelaron que la cepa original que afecto a Estados Unidos de PEDV (US PEDV cepa prototipo) era genéticamente similar a las cepas circulantes en China durante 2011 y 2012. Hoy en día PEDV se ha descripto en más de 10 países productores de cerdos incluyendo México, Perú, República Dominicana, Canadá, Colombia, Ecuador y Ucrania.

PEDV puede afectar a cerdos de todas las edades causando diarrea acuosa acompañada de anorexia y depresión. La morbilidad pude llegar al 100% en lechones y es variable en cerdas. El periodo de incubación es variable, siendo de 24 hs a 8 días, dependiendo de la dosis infectante, cepa y tipo de infección.

El intervalo entre el comienzo y finalización de los signos clínicos pueden llegar a durar tres o cuatro semanas. La eliminación viral puede detectarse dentro de las 48 h pos infección y puede durar hasta 4 semanas. La severidad de la enfermedad y la tasa de mortalidad es inversamente proporcional a la edad de los animales afectados. En animales de hasta una semana de edad, la infección por PEDV, se caracteriza por diarrea acuosa severa, vómitos que duran entre 3 a 4 días, seguido de deshidratación severa y desbalance electrolítico, lo cual lleva a la muerte. La tasa de mortalidad promedio es de 50%; comúnmente llegando al 100% en animales de 1 a 3 días de edad. En animales en el periodo post destete hasta animales de terminación, los signos clínicos son autolimitantes y desaparecen dentro de una semana de comenzada la infección. Sin embargo, cuando la infección ocurre durante estas etapas productivas, la tasa de crecimiento pude verse reducida significativamente. La infección en cerdas reproductoras generalmente no produce diarrea, pero los animales infectados manifiestan depresión y anorexia. Las cerdas también pueden tener fallo reproductivo debido a la manifestación sistémica como fiebre, agalactia y retraso en el estro. 

Las lesiones macroscópicas están confinadas al tracto gastrointestinal y se caracterizan por asas intestinales con pared delgada, transparentes, distendidas por gas, las cuales contienen abundante contenido acuoso amarillento. El estómago puede estar distendido con gas y contener pequeñas cantidades de leche coagulada. Las lesiones histológicas son consistentes con cambios observados en lesiones virales tipo y se caracterizan por fusión, atrofia y acortamiento de las vellosidades intestinales. Los enterocitos presentan edema intracitoplasmico y vacuolización, y ocasionalmente necrosis individual con descamación de células en la luz intestinal y contracción en la lámina propia. PEDV se replica en el citoplasma de las células epiteliales de la vellosidad intestinal destruyendo los enterocitos blanco como resultado de necrosis masiva y/o apoptosis. Este proceso lleva a la atrofia de la vellosidad y una marcada reducción en la actividad enzimática. Esta secuencia de eventos  interrumpe la digestión, absorción de nutrientes y electrolitos, causando así una diarrea malabsortiva seguida por deshidratación fatal. Después de la infección con PEDV la severidad de los signos clínicos y la mortalidad están inversamente asociadas con la edad de los animales afectados. Sin embargo, la razón por la cual la infección con PEDV afecta más severamente a animales en pos destete no está totalmente dilucidada. 

La transmisión de PEDV ocurre principalmente por contacto directo o vía fecal-oral. La transmisión aérea de PEDV podría tener un papel en la infección en ciertas condiciones. PEDV puede entrar a las granjas a través de animales infectados clínica o subclinicamente, camiones, fómites contaminados por diarrea y vómitos, fuentes ambientales (transporte de alimentos, cerdos, deshechos), personas (dueños, empleados, visitantes, veterinarios, camioneros, etc.,) o animales salvajes y aves. Otras potenciales fuentes de infección de PEDV pueden ser aditivos o ingredientes de comida, incluyendo plasma porcino deshidratado. La desinfección e higiene inadecuada después de un brote agudo de PEDV en las salas de maternidad, la persistencia en animales destetados en los corrales de engorde y terminación, donde también puede circular el virus, pueden causar una diarrea post destete moderada con una baja tasa de mortalidad. En este cuadro endémico, el virus circulante en la granja va a infectar a los cerdos susceptibles (cerdo recién nacido incapaz de obtener buena protección calostral) los cuales serán la fuente de infección recurrente para brotes epidémicos llevando a una alta mortalidad.

El genoma de PEDV es aproximadamente 28 kb y consiste de una región no traducida 5’ (5’ UTR) y una cola 3’ poli(A), al menos 7 marcos abiertos de lectura (ORF1a, ORF1b, ORF2- 6), y una región no traducida 3’ (3’ UTR). El ORF1a y ORF1b codifican proteínas no estructurales, mientras que los otros ORF ubicados en la región 3’ codifican 4 proteínas estructurales: la espícula (S), proteína de membrana (M), proteína de envoltura (E), proteína de nucleocapside (N) y un gen accesorio ORF3. El virion es esférico y pleomórfico, con un diámetro variable entre 95-195nm. El virus es estable a 4ºC y completamente inactivado con pH superiores o inferiores a 4-9, por lo tanto, se puede desactivar con ácidos y desinfectantes alcalinos.

La proteína S de PEDV es la mayor proteína de envoltura y es responsable de interactuar con los receptores celulares durante la infección y de la inducción de anticuerpos neutralizantes por el hospedador. Estudios filogenéticos demostraron la utilidad de la secuenciación de la proteína S

en la determinación de la relación genética entre cepas de PEDV, el estudio de su estructura ha sido de gran valor para el desarrollo de test diagnósticos y para el desarrollo de vacunas. La proteína M se encuentra en mayor cantidad en la envoltura del virion y también juega un papel muy importante en la inducción de anticuerpos neutralizantes. La proteína E es una de las más pequeñas de la envoltura y expresada simultáneamente con la proteína M, ha demostrado que puede formar partículas virales, coronavirus-like, carentes de espícula. Las proteínas E y N se encuentran generalmente en el retículo endoplasmatico durante el procesamiento de ensamblaje viral. La proteína N tiene numerosas funciones, por ejemplo, protección del ARN genómico durante la traducción, y antagoniza la producción de interferón como parte de la estrategia de evasión inmunológica y activa NF-KB.

PEDV puede infectar un amplio rango de hospedadores incluyendo humanos, murciélagos y aves, pero típicamente la infección es productiva solamente en sus hospedadores específicos. Se sabe que los coronavirus tienen un alto tropismo por células epiteliales del aparato respiratorio y entérico, así como macrófagos. PEDV tiene un tropismo restringido por las células de la vellosidad intestinal de los porcinos. La aminopeptidasa N del cerdo (pAPN) la cual se expresa predominantemente en la superficie de los enterocitos ha sido identificada como el receptor necesario para la infección. La porción N-terminal de la proteína S1 es necesaria para el reconocimiento del receptor pAPN. Así la infección comienza por la fusión de pAPN seguido por la internalización del virus con la fusión directa de membranas de la envoltura viral y del hospedador, con la subsecuente liberación del genoma viral en el citoplasma seguido por el desenvolvimiento viral y la replicación del genoma.

Experimentalmente se ha visto que PEDV puede replicar en células de riñón de mono (Vero, MARK-145). En estos sistemas in vitro la presencia de receptores heparan sulfato sirven como medio de adhesión del virus. La adhesión de tripsina es indispensable para el aislamiento y pasajes en células Vero, así la tripsina facilita la entrada y liberación de PEDV a través de la escisión de la proteína S en las subunidades S1 y S2. La infección viral in vitro resulta en la producción de múltiples efectos citopáticos incluyendo fusión celular, vacuolización, formación de sincitios y descamación celular. La replicación viral y los subsecuentes efectos patológicos son el resultado de la habilidad de PEDV para interactuar con múltiples procesos intracelulares. Se sabe que puede inducir apoptosis a través del factor mitocondrial-inductor-apoptosis caspasa-independiente. PEDV puede activar las tres mayores proteinkinasas que actúan como mitógeno celular. A demás se cree que puede inducir estrés celular y activar NF-Kβ.

Uno de los factores más importantes para el diagnóstico de PEDV es su gran similitud clínica observada durante las infecciones con TGEV y PDCoV. Así, el diagnostico no se puede realizar sobre la base de los signos clínicos, cambios macroscópicos o histopatológicos. Por lo tanto, el diagnóstico diferencial de estos tres agentes se debe realizar en el laboratorio. Hoy en día se cuenta con una variedad de métodos de detección de PEDV los cuales incluyen inmunofluorescencia, inmunohistoquímica, hibridación in situ, ELISA, y numerosos tipos de RT-PCR. Debido a su sensibilidad y la rapidez para la obtención de los resultados, equipos comerciales de PCR, fueron y son lo más ampliamente utilizados durante brotes epidémicos. 

La secuenciación del gen S, así como la combinación de secuenciación y RT-PCR se consideran herramientas óptimas para el monitoreo y estudio de diversidad genética entre aislamientos de PEDV. Para la detección de anticuerpos se utiliza inmunofluorescencia indirecta, ELISA y virus neutralización. Debido a programas de manejo donde se le presta una gran importancia al calostrado de los lechones, la detección de anticuerpos contra PEDV en cerdas no parece ser tan importante. Sin embargo, el rol de los anticuerpos neutralizantes en el calostro juega un papel preponderante, por lo tanto, la detección o cuantificación de anticuerpos neutralizantes contra PEDV, especialmente contra la proteína S en suero o en calostro, son necesarios para la evaluación de los niveles de inmunidad de las cerdas. Anticuerpos contra PEDV se detectan tempranamente aproximadamente 6-14 post infección.

La respuesta inmune específica contra las proteínas N y S del virion presenta diferente magnitud y diferente dinámica. El pico de IgM especifico contra la proteína N y S llega a su pico a los 7 y 14 DPI respectivamente. La respuesta IgG especifica se detecta tempranamente a los 7 DPI para ambas proteínas con su pico los 14 y 21 DPI para la proteína N y S. Aparición de las cepas PEDV S-INDEL

En enero de 2014 se observaron brotes clínicos de PEDV caracterizados por diarrea moderada. El análisis filogenético de las cepas de PEDV aisladas durante este brote identificaron una nueva variante de PEDV. Esta nueva cepa variante de PEDV comparada con la cepa US PEDV prototipo contiene inserciones y supresiones en el gen de la espícula por lo cual se la llamo cepa S-INDEL (INDELS). Desde el primer brote de PEDV reportados en los Estados Unidos la cepa US PEDV prototipo se ha reportado en Canadá, México, Taiwán, Corea del sur y Ucrania mientras que la cepa US-INDEL fue reportada en Corea del Sur, Alemania, Bélgica, Francia, Portugal, Japón, Italia y Austria, lo cual demuestra una gran y rápida distribución de esta nueva variante.

Estudios de patogenia mostraron diferencias en patogenicidad entre las cepas PEDV convencionales y las cepas INDEL. Clínicamente todos los cerdos infectados con diferentes cepas prototipo de PEDV mostraron diarrea severa por un periodo de 6- 7 días mientras que animales infectados con la cepa INDEL solo mostraron diarrea transitoria mínima un día post infección. Todos los animales inoculados con las cepas prototipo también mostraron severa deshidratación, anorexia, perdía de peso corporal mientras que en los animales inoculados con la cepa INDEL no se observaron signos de deshidratación, anorexia ni pérdida de peso corporal.

Las lesiones macroscópicas observadas 3 días post infección con cepas PEDV prototipo fueron caracterizadas por paredes intestinales trasparentes, adelgazadas de tamaño, distendidas por gas y contenido liquido de color amarillo. Mientras que los animales inoculados con la cepa PEDV INDEL solo mostraron moderada dilatación del colon. Histológicamente las lesiones estuvieron caracterizadas por edema epitelial, atrofia de las vellosidades y colapso de la lámina propia. Ambos grupos, PEDV prototipo y PEDV INDEL presentaron lesiones histológicas consistentes con infección viral 3 días post infección. Sin embargo, a los 7 días post infección el grupo INDEL no presento lesiones detectables con infección viral. Finalmente, recientes estudios serológicos, ha demostrado que ambas cepas PEDV INDEL y prototipo tiene reacción cruzada y podrían tener protección cruzada basado en los ensayos de virus neutralización.

Una tercera variante del virus PEDV (PC177) prototipo descripto durante el brote de PEDV de 2013 se ha identificado en cultivo celulares. Esta nueva variante tiene una gran deleción en el gen de la espícula de unos 197 amino ácidos. A pesar que esta tercera variable se aisló de casos clínicos, por lo cual se cree en su carácter patogénico, no hay información específica referente a su patogenicidad y presentación clínica.
 

El virus de la gastroenteritis transmisible fue el primer coronavirus descripto como causal de enfermad entérica en cerdos. Los primeros reportes datan de 1946 en Estados Unidos y hoy en día se considera que su distribución es mundial, afectando a la mayoría de los países productores de cerdos. Los brotes epidémicos asociados con su infección son cada vez menos frecuentes desde la aparición de PRCV debido a la protección cruzada generada por este virus. Sin embargo, los brotes siguen causando enfermedad fatal cuando el virus ingresa en granjas sin previa inmunidad. En Asia este virus sigue siendo de gran importancia clínica y económica ya que han emergido nuevas variables. En el año 2012 un nuevo brote epidémico fue reportado causando grandes pérdidas económicas producidas por una nueva variable con del virus originalmente descripto en Estados Unidos.

TGEV es un virus pleomórfico con proyecciones de membrana de forma radial de unos 75- 160 nm. El virus está predispuesto a una gran evolución genética con acumulación de mutaciones puntuales para los genes que codifican las proteínas estructurales y no estructurales. La envoltura viral está compuesta por 5 proteínas (M, sM, HE, S e I). el virus se puede adherir a el receptor celular a través de la espícula por medio de la aminopeptidasa.

Se ha propuesto un segundo mecanismo de adhesión a través de los receptores de ácido siálico, el cual juega un papel diferencial en algunas cepas de TGEV. La secuencia de la porción terminal 5’ diferencia a TGEV de otros coronavirus.

La mayor vía de transmisión de TGEV es fecal-oral. Tiene un periodo de incubación breve que varía de 18 hs a 3 días. Una vez que los cerdos son expuestos, el virus alcanza el tracto gastrointestinal y se adhiere a los receptores de los enterocitos de la vellosidad (pAPN) seguido por internalización y absorción por parte de los enterocitos. El virus se replica en los enterocitos produciendo lisis celular, la cual como resultado produce reducción en el tamaño de la vellosidad, fusión y atrofia. Clínicamente también se observa diarrea de tipo malabsortiva la cual es el resultado de la disminución de la actividad enzimática debido al daño de la mucosa intestinal. Sumado a esto el aumento de material no digerido en el lumen intestinal, puede agravar el cuadro produciendo diarrea osmótica. La muerte de los animales generalmente se produce por deshidratación y acidosis metabólica. Los animales más jóvenes son los más severamente afectados ya que no tienen una alta tasa de reposición de los enterocitos dañados. Otra de las razones por la cual la deshidratación es más severa en animales jóvenes es la falta de absorción compensatoria de fluidos en el intestino grueso, comparado con animales en la etapa de crecimiento y terminación

La enfermedad tiene dos presentaciones clínicas. Una presentación epidémica en la cual todas las categorías de animales pueden ser afectadas, pero con una alta tasa de mortalidad (100%) en neonatos. La forma endémica se presenta en animales expuestos pero que ha tenido previa exposición a anticuerpos calostrales. En la forma epidémica de TGE los signos clínicos incluyen vómitos transitorios, diarrea acuosa la cual puede contener floculos de leche sin digerir, pérdida de peso, deshidratación, asociado con alta morbilidad y mortalidad especialmente en cerdos menores a dos semanas de edad. Debido a los fallos en la digestibilidad causados por los daños de la mucosa, se puede observar esteatorrea. Animales afectados mayores de 3 semanas de edad pueden sobrevivir a la infección, pero generalmente muestran un marcado retraso en el crecimiento. Los animales afectados durante engorde y terminación pueden mostrar inapetencia, diarrea y vómito, por un periodo variable de tiempo. Los signos clínicos observados durante los brotes endémicos son similares, pero presentan menor severidad que los observados en animales seronegativos de la misma edad.

Dentro de las lesiones macroscópicas que se observan en animales que han sufrido TGE, se destacan deshidratación (ojos hundidos, piel apergaminada) y diarrea (heces liquidas en la región perineal y ausencia de heces solidas en intestino grueso), las paredes intestinales están adelgazadas, transparentes, distendidas por gas, con severa congestión de los vasos mesentéricos.

Uno de los cambios histológicos más remarcables es la evidencia de la atrofia de la vellosidad en la cual se puede observar una relación vellosidad-cripta 1:1 la cual en cerdos normales es 7:1. Las regiones anatómicas más comúnmente afectadas son yeyuno seguida por duodeno y menos comúnmente afectado el íleon. Los daños del enterocitos son agudos; caracterizados por vacuolización intracitoplasmática, degeneración y necrosis celular. La reacción inflamatoria es escasa o mínima. Los animales que se recuperan pueden presentar una hiperplasia compensatoria de las criptas. La vellosidad puede estar recubierta por epitelio regenerativo plano con pérdida de polaridad nuclear y perdida de las microvellosidades de los enterocitos. Otra importante característica de las lesiones es su distribución multifocal, por lo cual múltiples segmentos deben ser evaluados durante los estudios histopatológicos.

El diagnóstico de TGE se puede realizar sobre la base de los signos clínicos y el cuadro epidemiológico. Sin embargo, cabe recordar que los signos clínicos agudos no difieren de los observados de la infección por PEDV. Por lo tanto, la confirmación etiológica es necesaria para el diagnóstico de un brote de TGEV. Se pueden utilizar numerosas técnicas como detección de antígeno viral por inmunofluorescencia e inmunohistoquímica. También se puede hacer detección de ácido nucleico por PCR, hibridación in situ. Otro método confirmatorio es el aislamiento viral y la detección por microscopia electrónica. El diagnostico serológico puede ser de gran importancia, sin embargo, su interpretación debe realizarse con mucho cuidado debido a la similitud antigénica entre TGEV y PRCV. Una alternativa, sería la utilización de pruebas de ELISA de bloqueo. Debido a la gran prevalencia de estos dos agentes es importante también recordar la presencia de anticuerpos maternales, por lo tanto, para la determinación de la seroprevalencia en los establecimientos afectados, se deben monitorear animales, entre 2 a 6 meses de edad una vez que los anticuerpos maternales han desaparecido.

La inmunidad sistémica relacionada con TGEV se puede observar de 7 a 14 días post infección y en estudios de campo se demostró que los anticuerpos pueden durar hasta 6 meses en animales reproductores. Sin embargo, el rol de IgG sistémica en la respuesta inmune contra TGEV no está completamente establecido. La presencia de anticuerpos neutralizantes en el suero no tiene un papel fundamental en la protección contra la infección con TGEV, pero si la presencia de IgA secretoria en la mucosa intestinal. Se cree que el rol más importante en la producción de IgA local está producido o regulado por las células M de la mucosa en vez de los linfocitos de la lámina propia. Debido a las características de infección de mucosa y a la edad en que los cerdos tienen mayor predisposición a la infección, la inmunidad calostral (IgA-IgG) juega un papel fundamental en la protección contra este agente. Se ha demostrado que la infección oral en cerdas seronegativas resulta en una alta tasa de protección en cerdas lactantes. En estas cerdas esta protección pasiva se ha asociado con altos títulos de IgA en calostro y leche. La presencia de IgG especifica en estas cerdas decae rápidamente en la leche y no brinda protección pasiva. 

 

PRSCV es una variante del TGEV que se describió por primera vez en Europa a principios de la década del 80. A principios de los 90 un virus similar se detectó en los Estados Unidos. Estudios serológicos llevados a cabo en Bélgica encontraron sorprendentemente una alta seroprevalencia contra TGEV. Algo llamativo durante este relevamiento fue la alta prevalencia serológica pero la falta de reportes asociados con brotes endémicos o epidémicos de diarrea. Seguido a esto se realizaron múltiples intentos de aislamiento de TGEV sin resultados positivos. Estudios longitudinales para tratar de dilucidar este problema mostraron que los animales provenientes de madres seropositivas perdían sus anticuerpos calostrales entre 16-18 semanas de edad, sin embargo, en otras granjas los anticuerpos maternales caían a las 6-9 semanas de edad, pero volvían a incrementar, lo cual sugería una infección con TGEV. Durante estos estudios un virus TGE-like fue asilado de hisopado nasales y heces, el cual podía ser neutralizado con sueros anti-TGEV. Estudios posteriores mostraron que la estructura genética de PRCV era muy similar para la descripta en otros coronavirus porcinos. Sumado a esto se observó que PRCV y TGEV comparten numerosos sitios antigénicos. Sin embrago PRCV presenta una deleción en la región S y otra en el ORF3 del virion lo cual lo hace patogénicamente diferente. Desde este primer aislamiento de PRCV la prevalencia clínica y el impacto económico de TGEV ha declinado.

PRCV ha sido asociado a enfermedad respiratoria, afectando mayormente al aparato respiratorio superior e inferior. Las lesiones observadas no difieren mayormente de otra enfermedad viral. Se observa marcada neumonía bronco intersticial caracterizada con pulmones expandidos por edema que no colapsan durante la necropsia. Histológicamente se observan manguitos perivasculares y agregados linfocitarios peribronquiales. Se observa también engrosamiento de las paredes alveolares debido a la gran infiltración con macrófagos y linfocitos. En casos subagudos a crónicos puede haber hiperplasia e hipertrofia de los neumocitos tipo 2. También se puede observar acumulación de células necróticas en la luz de los alveolos y bronquiolos debido al daño epitelial bronquiolar que produce la infección viral. Las lesiones pueden se pueden reparar o regenera, si no hubo infección secundaria en aproximadamente 10 días post infección.

El diagnostico se puede realizar sobre la base de la signología clínica. Al igual que la infección por PEDV, TGEV y PDCoV no puede distinguirse entre sí, o con otros virus entéricos. De la misma manera la infección con PRCV no pude diferenciarse clínica o histológicamente de la infección con otros virus respiratorios. Por lo tanto, el diagnostico debe ser apoyado por el diagnostico etiológico. Se puede realizar detección del antígeno por inmunohistoquímica o detección del ácido nucleico por hibridación in situ o RT-PCR, inmuno-microscopia electrónica y/o aislamiento viral. La evaluación serológica no es de gran valor diagnostico debido a la inmunidad cruzada inducida durante la infección con TGEV. En este caso se debe combinar la evaluación clínica e histopatológica, asociando la presencia de anticuerpos con la presencia de signos clínicos respiratorios, lesiones pulmonares de tipo viral y ausencia completa de signos entéricos. El diagnostico a través de RT-PCR es de mucha ayuda para hacer el diagnóstico diferencial entre PRCV y TGEV. Hay numerosos tipos de PCR diseñadas para la diferenciación entre ambos agentes. Se puede realizar RTPCR dirigida a la región S las cuales deberían tener como blanco la región deleteada del PRCV para hacer el diagnóstico diferencial. También se pueden realizar RT-PCR mutiplex la cual podrían distinguir la gran mayoría de los coronavirus porcinos incluyendo PEDV, TGEV, PDCoV y PRCV. La inmuno-microscopía electrónica es otra técnica la cual permite la diferenciación entre PRCV y TGEV. Durante el aislamiento viral, el cual se realiza principalmente en células renales o testiculares de cerdo, se puede observar un efecto citopático caracterizado por edema intracelular, alargamiento, degeneración y citólisis.

La confirmación viral debería hacerse por inmunofluorescencia con anticuerpos PCRV especifico o RT-PCR diferencial. El diagnóstico serológico se puede realizar a través de la prueba de ELISA y virus neutralización. Los resultados deber ser interpretados cautelosamente ya que TGEV y PRCV inducen anticuerpos neutralizantes que son cuantitativamente y cualitativamente similares. La manera de prevenir las variables durante la interpretación serológica seria utilizando ELISAs de bloqueo los cuales permiten detectar una respuesta diferencial entre PRCV y TGEV.

Estudios experimentales han mostrado que PRCV puede ser aislado de la mucosa nasal, tonsila, tráquea y pulmón. El virus también se ha recuperado de estómago, intestino delgado, suero linfonodos mesentérico y colon y menos fruentemente en bazo, hígado y timo. A través de la marcación del virus con inmunofluorescencia se ha demostrado que PRCV infecta las células epiteliales de la mucosa nasal tonsila y tráquea, así como macrófagos alveolares. En los pulmones la inmunofluorescencia fue detectada mayormente en epitelio respiratorio y mucosa bronquial y bronquiolar. Estudios experimentales han demostrado que las lesiones y la presencia de antígeno in situ fue observada 3 días post infección y la viremia se puede detectar ya a partir del segundo día post infección. Otro estudio demostró que la edad de infección puede jugar un papel fundamental en el desarrollo del signología clínica. A pesar que PRCV se detectó en el aparato respiratorio y digestivo, se ha observado que cuando los animales son infectados con más de 5 semanas de edad las lesiones se limitan únicamente al tracto respiratorio, lo cual hablaría de un cambio en la dinámica de los receptores de adhesión por parte del hospedador asociado con la edad. Se ha observado que PRCV puede infectar animales adultos, mayormente animales en terminación que ya han perdido la protección de los anticuerpos maternales. En estos casos las lesiones no estaban claramente establecidas lo único que se ha podido determinar fue una escasa replicación viral en alveolos o células del aparato respiratorio superior a través de la marcación por inmunofluorescencia.

Hasta el día existe el debate sobre cuán importante es la manifestación clínica de PRCV.

Originalmente se lo considero apatogeno, ya que el virus se podía aislar de animales asintomáticos sin signos respiratorios. Algunos reportes de campo han asociado la infección de PRSCV con enfermedades respiratorias en animales de engorde, terminación e incluso reproductores. Los signos clínicos asociados con la infección con PRCV son completamente inespecíficos y puede variar desde tos seca, hasta inapetencia por varios días, fiebre, y en reproductores puede haber agalactia.

En estudios experimentales se ha tratado de reproducir la enfermedad clínica; donde los resultados han sido variables. Esto puede ser debido a la técnica de inoculación o inclusive a la edad de los animales infectados. En los casos de campo donde se ha detectado la presencia del virus, no se han detectado cambios patológicos. Solamente una bronconeumonía catarral la cual histológicamente se confirmó como neumonía intersticial con degeneración alveolar y necrosis del epitelio bronquiolar.

Referente a la inmunidad contra PRCV se observado que después de la inoculación intranasal, el titulo de anticuerpos aumenta entre tres a cuatro semanas. La inmunidad no dura de por vida y lo animales reproductores mantienen un nivel de anticuerpos elevado debido a que sufren una reinfección constante en el campo. La respuesta inmune de PRCV no ha sido claramente estudiada. La respuesta inmune activa en las asas intestinales esta probablemente relacionada a la presencia de IgA secretoria producida por células linfoideas de la lámina propria. Células secretoras de IgA se han observado en infección con TGEV cuando el virus se administró de forma a oral pero no de forma parenteral. La presencia de anticuerpos sistémicos solo indicaría una infección activa por TGEV o PRCV. También se ha observado que durante la infección hay un componente de inmunidad celular. La evidencia más clara de la protección de PRCV contra TGEV se observó cuando se infectaron animales de 6 semanas carentes de anticuerpos maternales vía intranasal con PRCV, los cuales fueron infectados cuatro semanas más tarde con TEGV obteniendo un buen grado de protección clínica. El rol de la inmunidad pasiva conferida por la infección por TGEV con PRCV no está totalmente dilucidada. Se sabe que cerdas expuestas a TGE secretan grandes niveles de IgG e IgA en el calostro los cuales producen la protección contra TEGV y cabría esperar que podrían neutralizar parcialmente PRCV que llega al tracto gastrointestinal. Por otro lado, la protección cruzada que confiere la inmunidad pasiva entre PRCV y PEDV es uno los factores más importantes que han ayudado a disminuir la prevalencia de TGEV en granjas endémicamente afectadas con TGEV/PRCV.

Este es el único coronavirus neurotrópico que puede afectar el cerdo. Este virus fue aislado por primera vez en Canadá de cerdos lactantes con encefalomielitis. Años más tarde fue aislado en Inglaterra en cerdos que presentaron vómito, anorexia y depresión. La enfermedad pudo ser reproducida experimentalmente en cerdos. En los últimos años las investigaciones relacionadas con PHEV han aumentado debido al aumento de la tasa de infección reportada en algunos países.

Desde su primer reporte en 1958 en Canadá, muchos países reportaron la presencia de PHEV. En China el primer reporte de PEHV data de 1985 con una tasa de mortalidad del 80.6%. El brote epidémico más grande reportado ocurrió en Taiwán en 1994 y presento una tasa de mortalidad del 100%. En agosto de 2006 la enfermedad se describió por primera vez en Argentina con una tasa de morbilidad de 52.6% y una tasa de mortalidad del 16.9%. En el año 2007 se describió un rebrote de esta enfermedad en China el cual afecto principalmente a cerdos de 20 días de edad con una tasa de mortalidad del 48%. A demás estudios serológicos demostraron que la prevalencia de PHEV es alta y han demostrado que la enfermedad esta diseminada mundialmente. La seroprevalencia reportada para PHEV en Canadá fue del 31%, Irlanda 46%, Inglaterra 49%, Japón vario del 52% al 82% y EEUU del 11% al 99%.

La infección con PHEV causa vómito y adelgazamiento extremo, encefalomielitis en cerdos de menos de 3 semanas de edad, particularmente en cerdos que carecen de anticuerpos maternales. La infección se produce unos pocos días después del parto afectando a camadas completas. Los animales presentan además de vómitos, ataxia, hiperestesia, incoordinación, letargia, seguido por opistótonos y pedaleo, finalmente terminado con la muerte dos a tres días después del comienzo de los signos clínicos. Este virus se disemina al sistema nervioso central a través de los nervios periféricos. Las células nerviosas son el sitio de replicación viral. PHEV puede ser aislado en cultivos primarios de células renales de cerdo. Estudios experimentales han demostrado que una de las vías para la infección es a través de la mucosa nasal y tonsilas produciendo una infección ascendente a través del nervio trigémino al ganglio trigémino del sistema nervioso central y a los núcleos sensitivos. 

Las lesiones macroscópicas observadas en lesiones experimentales son inespecíficas, pero están relacionadas con problemas motores del tracto gastrointestinal. Así los animales afectados presentan caquexia, dilatación estomacal y en casos más severos dilatación abdominal. Dentro de los hallazgos histológicos más característicos se observa la presencia de encefalomielitis no supurativa. Otros cambios histológicos incluyen manguitos perivasculares linfoplasmocitarios, gliosis y degeneración neuronal. Las lesiones son más pronunciadas en la sustancia gris a nivel del puente, medula oblongada y los cuernos dorsales de la medula espinal. Los cambios histológicos que afectan al estómago se han observado solamente en animales que presentaron el síndrome de vómito y adelgazamiento. Se ha observado degeneración de los plexos neuronales del estómago, así como agregados linfoplasmocitarios perivasculares. Las lesiones son más pronunciadas en la región pilórica. 

El diagnostico de esta entidad está basado en la presentación clínica. Un incremento marcado en mortalidad en lechones menores a tres semanas asociado con vómito, con estómagos distendidos y signología nerviosa; deben ser indicativos de la infección con PHEV. El diagnostico etiológico se puede realizar a través de la detección ácido nucleico viral por PCR, aislamiento viral e inmunofluorescencia. El diagnostico in situ se puede realizar a través de inmunohistoquímica e hibridación in situ. El diagnostico serológico se puede realizar por medio de la técnica de inhibición de la hemaglutinación (HI), ELISA y virus neutralización (VN)

Al presente no hay información sobre la respuesta inmune inducida por la infección con PHEV. Sin embargo, se sabe que los brotes de esta enfermedad son más marcados en granjas donde los animales reproductores no presentan anticuerpos. Por lo tanto, se puede especular que la protección calostral juega un papel determinante en la protección y prevención de las manifestaciones clínicas.

PDCoV fue detectado en Ohio, Estados Unidos en febrero de 2014 en casos de diarrea neonatal en cerdos. Para diciembre de 2014, 17 estados en Estados Unidos reportaron casos positivos. Sin embargo, en un estudio retrospectivo, se detectaron muestras positivas por RTPCR desde agosto de 2013 y serología positiva desde 2010. Durante un relevamiento molecular llevado a cabo en Hong Kong otros Deltacoronavirus fueron identificados en aves y mamíferos incluyendo dos Deltacoronavirus porcinos (HKU-15-44 y HKU-15-155). Este estudio retrospectivo mostro que el virus había estado circulando en China desde al menos el año 2009. Al día de hoy la introducción de PDCoV a los Estados Unidos sigue siendo una controversia. Estudios filogenéticos demostraron que la secuencia nucleotídica detectada de PDCoV en Estados Unidos tiene más del 99.8% de identidad con las cepas de aisladas en Hong Kong y Corea, lo cual hace pensar un ancestro común o la introducción del virus por otros medios. Desde el primer brote reportado de esta entidad en Estados Unidos hasta el día de hoy, PDCoV ha sido reportado en China, Canadá, Corea del Sur, y Tailandia.

La organización genómica de PDCoV tiene el siguiente orden: región no traducida 5’ (UTR 5’), marco abierto de lectura 1a/1b (ORF1a/1b), espícula (S), envoltura (E), membrana (M), proteína no estructural (NS 6), nucleocapside (N), proteína no estructural 7 (NS7), región no traducida 3’ (UTR3’). Al igual que en otros coronavirus entérico porcinos la proteína S es la responsable de inducir la mayor respuesta inmune. Además, debido a su similitud con la proteína S de los otros coronavirus entérico porcinos, se cree que es la responsable de la interacción con los receptores de los enterocitos permitiendo la infección. 

PDCoV al igual que PEDV y TGE produce efectos citolíticos y afecta los enterocitos causando necrosis aguda la cual se ve representada por atrofia de las vellosidades. A diferencia de PEDV y TGE, PDCoV no produce apoptosis de los enterocitos en intestino delgado. Los antígenos de PDCoV y el ácido nucleico, pueden ser detectados en el intestino delgado (duodeno e íleon) e intestino grueso. A pesar que se cree que PDCoV puede interactuar con la aminopeptidasa como receptor para su adhesión e infección de los enterocitos, al igual que lo hacen PEDV y TGEV, todavía no se demostró experimentalmente esta interacción. A diferencia de PEDV el cual afecta principalmente a los enterocitos, PDCoV se ha detectado también en células presentadoras de antígeno de la lámina propia intestinal. Estudios experimentales demostraron la presencia de PDCoV en áreas de neumonía intersticial

La presentación clínica, así como la severidad de las lesiones ha sido variable en diferentes estudios, lo cual indica que los resultados dependen de las condiciones experimentales. En un estudio realizado en EEUU se observó que la infección por PDCoV no causo más que el 40% de mortalidad, una tasa mucho menor que la observada en PEDV. Sin embargo, en un estudio similar realizado en China, la mortalidad alcanzo al 80%. Al igual que PEDV y TGEV, la diarrea inducida por PDCoV es de tipo malabsortiva debido a la pérdida masiva de los enterocitos de la vellosidad intestinal, sumado a esto, al igual que en la infección con PEDV, la vacuolización que se observa en los enterocitos del colon puede interferir con la reabsorción de agua y electrolitos. La pérdida de estos enterocitos superficiales también produce una pérdida masiva de enzima digestivas, lo cual conlleva a la acumulación de material sin digerir en el lumen intestinal. Este material no digerido incrementa la presencia de diarrea tipo osmótica.

Basados en estudios experimentales, el comienzo de la signología clínica es agudo, coincidiendo con la eliminación viral unas 24-48 hs post infección. Una vez comenzados los signos clínicos, la diarrea puede persistir por aproximadamente 5 a 10 días. La eliminación de PDCoV en heces se puede observar inclusive una vez que los animales se recuperan de la enfermedad. Se sabe que la edad de infección en PEDV juega un papel fundamental en la severidad de los signos clínicos (tasa de reparación intestinal más lenta, e insuficiente maduración del colon en neonatos comparado con animales destetados), al momento no hay estudios que puedan avalar este mecanismo durante la infección de PDCoV. La severidad de los signos clínicos también puede estar afectada por coinfecciones virales o bacterianas. Dentro de las coinfecciones más comúnmente descriptas en casos de campo en estudios llevados a cabo en los Estados Unidos se encuentra PDCoV y Rotavirus C en estudios realizados en China las coinfecciones más comúnmente observadas fueron PEDV y TEGV.

Los signos clínicos asociados con la infección de PDCoV son similares a la infección por cualquiera de los otros coronavirus entéricos, tales como PEDV y TGEV, por lo cual el diagnóstico clínico se hace dificultoso. Por lo tanto, la confirmación diagnóstica debe estar basado en diagnóstico de laboratorio. El diagnostico etiológico se puede dividir en métodos virológicos y métodos serológicos. Los métodos virológicos incluyen, detección de partículas virales por microscopia electrónica, así como la detección de ácido nucleico viral (RT-PCR e hibridación in situ), detección de antígeno viral (inmunofluorescencia, inmunohistoquímica) y detección viable del virus (aislamiento viral y bioensayos). Dentro de las técnicas serológicas, las más comúnmente utilizada, son la inmunofluorescencia directa, virus neutralización y ELISA.

La información referente a la respuesta inmune innata o adaptativa durante la infección de PDCoV es escasa. Después de la infección, se observa una marcada respuesta inflamatoria de la lámina propia compuesta de macrófagos, linfocitos, neutrófilos y escasos eosinófilos. En cerdos infectados experimentalmente se observó a los 14 días post infección, una buena respuesta de IgA e IgG específicas, así como anticuerpos neutralizantes.

Este mismo estudio demostró que los anticuerpos persistieron al menos hasta el día 42 post infección.

 

 

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