Avances para mejorar los resultados reproductivos en porcino utilizando semen criopreservado

La inseminación artificial (IA) es, posiblemente, la técnica de reproducción asistida que más impacto ha tenido sobre la producción animal en los últimos 50 ó 60 años (Córdova-Izquierdo, 2002), llegando, en el sector porcino, a presentar una amplia aplicación en todo el mundo.

La utilización de semen refrigerado (15-20 ºC) copa más del 99% de las inseminaciones artificiales realizadas en el mundo, quedando relegada la utilización de semen congelado/descongelado, bien a labores de investigación (Gadea, 2004), o bien a la incorporación de nuevo material genético de alto valor a núcleos de selección (Johnson et al., 2000; Gadea, 2004; Saravia, 2004), por lo que en la producción comercial porcina no se están aprovechando las grandes ventajas que la criopreservación seminal puede aportar, como el mayor control sanitario de las dosis (Bailey et al., 2008) o la gran disponibilidad espacio/temporal del material seminal (Domínguez et al., 2008).

La inseminación con semen criopreservado tiene un rendimiento reproductivo inferior al obtenido con semen refrigerado, tanto en el porcentaje de partos como en el tamaño de la camada, en torno a 2-3 lechones menos (Johnson et al, 2000; Roca et al, 2003), y es que los espermatozoides de porcino presentan una mayor susceptibilidad a la criopreservación que la mayoría de las especies domésticas.

De hecho, solo se observan porcentajes aceptables de fertilidad cuando la inseminación se realiza en el intervalo de 4 horas antes de la ovulación (Waberski et al, 1994; Roca et al, 2003). Se cree que el daño sufrido por el proceso de criopreservación podría inducir un efecto en los espermatozoides similar a la capacitación o al envejecimiento prematuro (Bravo et al, 2005; Ortega-Ferrusola et al, 2008), asociado a un incremento de la fragmentación del ADN (Fraser y Strzezek, 2007).

Aunque el daño infringido por el proceso de criopreservación puede considerarse la principal causa del bajo rendimiento reproductivo, para Eriksson (2000) existen otros factores que también limitan considerablemente la utilización del semen congelado:

Todos estos inconvenientes son los que han hecho que hoy en día la utilización de semen congelado/descongelado en el ganado porcino se haya reducido, aparte de su uso en investigación, a la producción en pureza en las granjas de selección genética, puesto que en este caso los rendimientos reproductivos, aunque no dejan de ser importantes, son secundarios con respecto a la consecución del objetivo primario, que es la mejora genética de los animales de explotación o la introducción en otros países de nuevas líneas selectas de bisabuelos/as y abuelos/as.

Desarrollo histórico de la crioconservación del semen de porcino

Las primeras experiencias de criopreservación seminal en porcino se realizaron en 1956 y continuaron desarrollándose durante la década de los 60 con resultados bastante satisfactorios en cuanto a la supervivencia celular se refiere no así en cuanto a los resultados  de fertilidad.

En 1970 se lograron resultados similares a los obtenidos con semen fresco, pero realizando la deposición directa de los espermatozoides en el oviducto, ya que si las células espermáticas se inoculaban vía cervical o en el extremo de los cuernos uterinos no prosperaban (Polge et al., 1970), lo cual fue achacado por los autores al daño que la congelación provocaba en la membrana espermática, que favorecería la destrucción celular por parte de los leucocitos durante el transcurso de los espermatozoides por el útero.

Un año después, en 1971, aparecen tres métodos de congelación para los espermatozoides de porcino que sí conseguían mantener la fertilidad tras una IA intracervical (Crabo y Einarsson, 1971; Graham et al., 1971; Pursel y Johnson, 1971 [citados en Bwanga, 1991]).

En 1975 se publican dos metodologías que han sido el referente de prácticamente todas las utilizadas hasta el día de hoy; por un lado, en EEUU, Pursel y Johnson (1975) con un método de congelación en pastillas o pellets y, por otro, en Alemania, Westendorf y sus colaboradores mediante un novedoso sistema de envasado en pajuelas.

Ambos trabajos fueron la base del abundante trabajo experimental llevado a cabo por la comunidad científica en los años venideros, con el fin primordial de conseguir optimizar las condiciones de congelación y descongelación, así como mejorar los resultados en el uso del semen congelado en el ganado porcino.

Situación actual

A partir de los trabajos de Pursel y Johnson (1975 y Westendorf son muchos y variados los avances logrados para tratar de hacer más rentable esta técnica.

Un avance sería la utilización de un catéter especial que permite depositar el material seminal más allá del cuello uterino (Martínez et al., 2001), con lo que se minimizan algunos de los inconvenientes, ya que además de incrementar los porcentajes de fertilidad (76-80 %) y prolificidad (9,3-9,5 lechones por camada), se consigue reducir el número de espermatozoides necesarios para llevar a cabo la inseminación (con el consiguiente aumento del número de dosis producidas lo que conlleva a una disminución del coste).

Otra de las líneas de investigación desarrolladas trata de buscar una mejor sincronización del momento de la ovulación con la llegada de los espermatozoides descongelados al oviducto, dada la reducida vida fértil que éstos presentan (Abad et al., 2006).

Últimamente también se ha centrado la atención en los fenómenos relacionados con las especies reactivas de oxígeno (reactive oxigen species [ROS]), que causan parte de las alteraciones estructurales y funcionales que sufre el espermatozoide porcino durante los procesos de congelación y descongelación; en este sentido, se han venido utilizando en los diluyentes de congelación enzimas (superóxido dismutasa [SOD], catalasa) o sustancias antioxidantes (α- tocoferol) con el fin de proteger, en cierto modo, a las estructuras espermáticas de su efecto nocivo, consiguiendo con ello implementar no sólo los resultados e motilidad e integridad de las membranas acrosómica y plasmática (Breininger et al., 2005), sino también la capacidad fecundante en pruebas de fecundación in vitro (Roca et al., 2005).

Avances para mejorar los resultados reproductivos utilizando semen criopreservado Son muchos los trabajos que han intentado dar solución a este problema de bajo rendimiento reproductivo cuando se utiliza semen criopreservado de porcino. Se ha intentado estudiar y actuar sobre los factores externos que afectan a la supervivencia y al mantenimiento de la capacidad fecundante de los espermatozoides tras el proceso de congelación, lográndose avances muy significativos:

 

Suplementación con plasma seminal

Con el fin de mejorar el rendimiento reproductivo del semen congelado de verraco realizamos un trabajo de investigación para examinar el efecto de la suplementación del semen congeladodescongelado de verraco con distintas concentraciones de plasma seminal (PS), sobre la calidad espermática y la fertilidad en la cerda mediante inseminación artificial cervical (IA-C).

En la primera parte de este trabajo se observa que el aumento de la concentración de PS provoca un aumento significativo de la viabilidad y movilidad espermática.

En la segunda parte del trabajo, se constata que la inseminación de cerdas con semen criopreservado reduce el porcentaje de gestación y el tamaño de la camada, efecto no observado cuando el semen congelado-descongelado fue suplementado con un 50% de PS.

Efecto de la suplementación con PS sobre la calidad espermática

Antecedentes

La inseminación con semen criopreservado tiene un rendimiento reproductivo inferior al obtenido con semen refrigerado, tanto en el porcentaje de partos como en el tamaño de la camada (Johnson et al, 2000; Roca et al, 2003). De hecho, solo se observan porcentajes aceptables de fertilidad cuando la inseminación se realiza en el intervalo de 4 horas antes de la ovulación (Waberski et al, 1994; Roca et al, 2003).

Se cree que el daño sufrido por el proceso de criopreservación podría inducir un efecto en los espermatozoides similar a la capacitación o al envejecimiento prematuro (Bravo et al., 2005; Ortega-Ferrusola et al, 2008), asociado a un incremento de la fragmentación del ADN (Fraser y Strzezek, 2007).

Los espermatozoides capacitados no forman un reservorio espermático funcional. Por tanto, el control de la capacitación y el envejecimiento prematuro del esperma representa un punto de interés para la mejora de la fertilidad asociada al uso de semen porcino criopreservado.

Mediante la tinción con clortetraciclina, se ha demostrado que la incubación en un medio suplementado con un 10% de PS, tanto con semen refrigerado como con congeladodescongelado, puede prevenir, y posiblemente revertir, la crio-capacitación (Suzuki et al, 2002; Vadnais et al, 2005a, b).

Nuestra aportación

Basándonos en estos estudios, formulamos la hipótesis de que el aumento de la concentración de PS usado en la reconstitución de semen congelado-descongelado mejoraría la fertilidad de la cerda utilizando IA-C.

Para evaluar esta hipótesis, se utilizaron 3 concentraciones de PS (0, 10 y 50%), en el caso de las valoraciones in vitro de la viabilidad y movilidad espermática.

Se seleccionaron 5 verracos en base a su fertilidad y calidad espermática como donantes de semen. Semanalmente se realizó una extracción seminal a cada verraco.

Posteriormente se procedió a la valoración seminal, utilizando únicamente eyaculados con ≥ 80% de espermatozoides móviles, ≥ 75% de espermatozoides morfológicamente normales y ≥ 95% de acrosomas normales, para la criopreservación seminal, donde se utilizaron dos eyaculados de cada uno de los verracos.

Para la incubación y valoración espermática, de cada uno de los eyaculados y del pool procedente de los mismos cinco verracos, se descongelaron y se incubaron dos pajuelas de semen de cada eyaculado en 40 ml de diluyente BTS que contenía 0%, 10% o 50% (v/v) de PS de cada verraco, o un pool de PS respectivamente. El PS se obtuvo mediante centrifugación de eyaculados procedentes de los mismos 5 verracos.

Se determinó la integridad de la membrana plasmática y la movilidad a las 0, 1, 2, 3 y 4 horas posteriores a la descongelación.

El aumento de la concentración de PS mejora la viabilidad y movilidad espermática (P ≤ 0,001).

Los porcentajes de espermatozoides vivos disminuyeron progresivamente durante el período de incubación de 4 horas. Además, cuando el esperma se incuba en un 50% de PS, el porcentaje de espermatozoides vivos es siempre superior (en todos los tiempos de valoración) en comparación con los espermatozoides que se incuban en un 0% o 10% de PS (P ≤ 0,0001). 

La adicción de un 10% de PS no tiene efecto sobre el porcentaje de espermatozoides vivos en cualquier punto de valoración, cuando se comparó con los espermatozoides que se incubaron en 0% de PS.

Efecto de la incubación del semen congelado-descongelado de verraco durante 4 horas en un medio suplementado con 0%, 10% o 50% de plasma seminal sobre la integridad de la membrana plasmática (% vitalidad).

Movilidad espermática

El porcentaje de movilidad de los espermatozoides disminuye progresivamente durante el período de incubación de 4 horas. La movilidad durante la incubación con un 50% de PS fue significativamente superior en todos los puntos de valoración (P ≤ 0,01), en comparación con las poblaciones de espermatozoides incubados con 0% o 10% de PS. Para la población de espermatozoides incubados en un 10% de PS, el porcentaje de espermatozoides móviles fue mayor a las 2, 3 y 4 horas en comparación con los espermatozoides que se incubaron en un 0% de PS (P ≤ 0,01).

Efecto de la suplementación con PS sobre la fertilidad de la cerda

Antecedentes

La respuesta a la suplementación de semen de verraco con PS ha demostrado ser impredecible cuando se ha estudiado la repercusión sobre la fertilidad de la hembra.

Según algunos autores, cuando el semen de verraco se suplementa con 0% o 10 % de PS, y se insemina entre 2 y 12 horas antes del momento previsto de la ovulación (MPO), no se observan diferencias en la fertilidad de la cerda (Abad et al., 2007), mientras que Okazaki et al., (2009) demuestran una mejora de la misma.

Este efecto beneficioso del PS sobre la fertilidad, es posible que no solo dependa del porcentaje de suplementación o de la viabilidad y movilidad de los espermatozoides, sino también del lugar de deposición de los espermatozoides en la hembra. Recientemente se ha observado que la IA-PC mejora los resultados de fertilidad del semen descongelado comparado con la IA-C (Casas et al., 2010; Roca et al., 2011).

Nuestra aportación

Para la valoración de la fertilidad de la cerda in vivo se utilizó únicamente la concentración del 50% de PS, habida cuenta de que la concentración de PS (50%) mejora significativamente la vitalidad y movilidad espermática como hemos visto anteriormente.

Se utilizaron 82 cerdas, las cuales recibieron una inyección de 900 UI de eCG en el momento del destete, seguida de 750 UI de hCG a las 80 horas.

Posteriormente se realizaron dos IA-C a las 36 y 42 horas después de la inyección de hCG.

Todas las cerdas fueron asignadas aleatoriamente por número de parto en 3 grupos dependiendo del tipo de inseminación realizada:

1. IA-C con semen refrigerado (3×109 espermatozoides),
2. IA-C con semen criopreservado (5×109 espermatozoides), y
3. IA-C con semen criopreservado (5×109 espermatozoides), suplementado con un 50% de PS.

El semen y el PS procedían de un pool de los mismos verracos utilizados en el experimento anterior.

Se valoró el estado de gestación utilizando la ecografía a tiempo real a los 28 días después de la inseminación dejando llevar a término la gestación.

Porcentaje de gestación y Tamaño de camada

La IA-C con semen criopreservado provoca una reducción del porcentaje de gestación y del tamaño de camada (P = 0,06 y P ≤ 0,05, respectivamente), sin embargo, este efecto no se observa cuando el semen descongelado se suplementa con un 50% de PS.

No hubo efecto del tratamiento sobre el porcentaje de partos.

En la siguiente tabla se muestran los resultados del efecto de la suplementación del semen criopreservado de verraco con un 50% de plasma seminal sobre la fertilidad de la cerda.

 

Podríamos concluir afirmando que la adicción de un 50% de PS a los medios de dilución de los espermatozoides para su descongelación mejora significativamente la viabilidad y movilidad espermática, prolongando la vida útil de los espermatozoides, con la consiguiente mejora en la fertilidad de la cerda.

 

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