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Responsable: De Luca Leonardo Niveles Plasmáticos de Progesterona en Receptoras de Embriones Congelados Determinados por Elisa-Test Buenos Aires - Argentina Contactar

La transferencia de embriones bovinos (sean frescos o congelados), como biotec­nología aplicada, reconoce varias etapas que se inician con le hembra dadora y fi­naliza con las receptoras.
Durante los últimos años se investiga con mayor énfasis la receptora y su influencia sobre el porcentaje de preñez, relacionándola con la raza, edad, estado sanitario, nivel nutricional y productivo (4, 9, 10, 11); por el momento los resulta­dos son contradictorios.
También debe establecerse un perfil endocrinológico que asegure la potencial fertilidad de la receptora y el establecimiento satisfactorio de una preñez (12,13), por cuanto, luego de la transferencia, es decisivo un cuer­po lateo (C.L.) funcional, que a su vez dependerá de las señales luteotróficas y antiluteolíticas del embrión.
Aún no está definida la concentración de progesterona (P4) necesaria para que un embrión sobreviva durante la tercera semana post-implante; pero sí se han de­mostrado fallas en la concepción cuando la concentración de P4 es inferior a 1 ng/ml (12, 13, 14, 15,16).
Por otro lado numerosas publicaciones señalan que los mayores índices de preñez, se logran con concentraciones de P4 que oscilan entre 2 y 5 ng/ml (13,14, 16, 18,19, 20, 21).
Este trabajo se propone establecer las siguientes relaciones:

1. Niveles plasmáticos de P4 y porcentaje de preñez.
2. Concentración de P4 y calidad del cuerpo lúteo.
3. Calidad del embrión, niveles plasmáticos de P4 y porcentaje de preñez.
   
   
   

MATERIALES Y METODOS

Durante el año 1986, en el Centro de Transferencia Embrionario "La Josefina", ubicado en San Antonio de Areco (Buenos Aires), fueron destinadas 163 vaquillonas Holando Argentino, (cuyas edades y pesos oscilaron entre 18 y 24 meses y 350 a 420 kg, respectivamente) a la transferencia de embriones congelados.
El programa de sincronización utilizado fue la doble aplicación de Cloprostenol 500 ug. (análogo de la prostaglandina F2 alfa), con un intervalo de 11 días.
En­tre las 48-96 horas después de la última inyección, presentaron celo manifiesto un total de 146 vaquillonas (74,0%).
El día de la transferencia las vaquillonas fueron sometidas a tacto rectal a los fines de evaluar:

a) presencia y tamaño del/los folículo/s;
b) localización y calidad de cuerpo lúteo. Para determinar la calidad del cuerpo lateo se estableció la siguiente escala subjetiva:

1 ó muy bueno: 15 a 25 mm de diámetro, con corona manifiesta.
2 ó bueno: 15 a 20 mm de diámetro, sin corona manifiesta.
3 ó regular: menos de 15 mm de diámetro, sin corona, con un folículo en cualquiera de los ovarios.
4 ó  malo: cuerpo lúteo muy pequeño, acompañado de un folículo con un diámetro de 5 a 15 mm.

En base a esta escala se seleccionaron 111 animales (68,0%) con cuerpo lúteo de tipo 1 ó 2 para ser transferidos quirúrgicamente (5). Antes de la misma se extra­jeron dos muestras de sangre en tubos con heparina, los cuales fueron centrifuga­dos y el plasma resultante almacenado a -22 ° C hasta su procesado.
La concentra­ción de P4 fue determinada por enzimoinmunoensayo (Elisa) semicuantitativo (Ovucar) en los rangos de 0,5; 1,0 y 5.0 ng/ml.
Los embriones utilizados fueron clasificados, después de la descongelación, en calidad 1 ó excelente y calidad 2 ó buena, según técnica ya descripta (5,6).
Todas las vaquillonas transferidas se observaron dos veces al día para determi­nar el intervalo de tiempo transcurrido en retornar al celo, de aquellas que no quedaron preñadas. Según el mismo, el celo se clasificó como:

Fisiológico: 18 a 23 días
Prolongado: 24 a 36 días
Extenso: más de 37 días

La preñez fue diagnosticada por tacto rectal entre los días 45 y 60 posteriores a la transferencia. En el análisis estadístico se utilizó el Test X2 (Ji cuadrado).


RESULTADOS

Sobre un total de 111 receptoras seleccionadas y transferidas, 56 de ellas (50.45%) presentaron preñez positiva al tacto rectal.
Las receptoras fueron divididas en dos grupos, A y B, de acuerdo al análisis de P4 plasmática. El grupo A lo constituyeron todos los animales cuyo plasma fue positivo a los patrones de 1 y 5 ng/ml. El grupo B engloba a las receptoras nega­tivas a todos los patrones, o positivas a 0.5 ng/ml.
Según Cuadro Nº 1 dentro del grupo A, de las 78 vaquillonas (70.2%; 78/111) se obtuvo preñez en 53 de ellas (67.9%), mientras que para el grupo B, de 33 recepto­ras (29.7%; 33/111) sólo resultan preñados 3 animales (9.09%). El porcentaje de preñez entre ambos grupos, muestra diferencias altamente significativas (P El Cuadro Nº 2 muestra el ordenamiento de las receptoras transferidas y los re­sultados de preñez en función de los niveles de P4 plasmáticos. Los porcentajes de preñez para cada uno de los grupos fue: 0.0%, 14.3%, 66.6% y 69.0%. Las dife­rencias son altamente significativas (P/,0.01) para cada uno de los niveles de P4.
El Cuadro Nº 3 establece la relación entre la calidad del cuerpo lúteo, nivel plasmático de P4 receptoras transplantadas y preñadas. Como puede observarse no hay diferencias significativas con el parámetro calidad del cuerpo lúteo, pero sí la hay con los niveles de P4 plasmáticos.
Además, se observaron las 25 receptoras del grupo P4 mayor a 1 ng/ml que no quedaron preñadas; 17 de ellas (68.0%) retornaron al celo en un período fisiológico (18 a 23 días); 5 (20%) tuvieron celo en un intervalo prolongado (23 a 36 días); mientras 3 receptoras (12%) manifestaron un intervalo Inter.-estrual post-transfe­rencia mayor de 37 días, posiblemente debido a mortalidad embrionaria.
Como puede observarse en el Cuadro Nº 4, no existe significación estadística en­tre la calidad del embrión (excelente o bueno) y la preñez lograda; pero vuelve a ser, significativa la preñez versus el nivel plasmático de la progesterona.
Se analizó el grado de repetibilidad del Test Elisa, evaluando las muestras por radioinmunoensayo. El coeficiente de correlación (r) fue 0.87 (22).
Los resultados de Hirako y col. (23) concluyen que el Elisa test para P4 plas­mático, posee la suficiente sensibilidad y precisión para ser usado "a campo"; con un coeficiente de correlación con el radioinmunoanalisis (R.I.A) de 0.97 (P<0.001).


CUADRO Nº 1 / Relación, Porcentaje de preñez-nivel plasmático de progesterona.

CUADRO Nº 2 / Porcentajes de preñez para cada concentración de P4 plasmática el día de la transferencia.

CUADRO Nº 3 / Porcentajes de preñez según niveles plasmáticos de P4 y su relación con la calidad del cuerpo lúteo.

CUADRO Nº 4 / Porcentaje de preñez según calidad del embrión y nivel de P4 en receptoras

Calidad del embrión	Nº de embriones Transferidos	Progesterona en receptoras	Nº de Preñadas
1 (excelente)	56	mayor a 1 ng/ml	43 (68.2) a
2 (bueno)	22	mayor a 1 ng/ml	10 (66.6) a
TOTAL	78	78 (100)	53 (67.9) A

Calidad del Cuerpo Lúteo	Concentración de P4	Nº receptoras transferidas	Nº de Preñadas
1	17	menor a 1 ng/ml	2 (11.7) b
2	11	menor a 1 ng/ml	1 (66.6) b
TOTAL	28		3 (10.7) B

a,b y A,B: letras diferentes indican diferencias significativas (

COMENTARIO

El objetivo de ésta experiencia fue evaluar el Elisa test (P4) como un criterio adicional en la selección de receptores al momento de la transferencia; con la i­dea de incrementar los índices de preñez.
Los resultados obtenidos coinciden con otras publicaciones, donde los mejores índices de preñez se logran en aquellas receptoras que presenten niveles de P4 plasmática entre 1 y 5 ng/ml (13, 16, 18, 19, 22). En nuestro caso llega al 67.9% (53/78).
La selección de una hembra receptora se rige, en primera instancia, por la observación de un celo manifiesto entre las 48 y 96 horas posteriores a la sincronización. Luego el diagnóstico de un cuerpo lúteo, clasificándolo en forma subjetiva, de a­cuerdo el tamaño, presencia de corona, elasticidad del tejido luteal, en sincronismo con el día del celo de referencia (20). Cualquier alteración en estos paráme­tros es suficiente para eliminar la receptora del programa. Lamentablemente, nin­guno de éstos criterios permite abrir juicio sobre la secreción hormonal del cuer­po lúteo (Cuadro Nº 3). No existe relación entre la calidad subjetiva del cuerpo lúteo y los niveles de P4, por cuanto el 29.2% de receptores con cuerpo lúteo-cali­dad 1, registraron concentración de P4 inferior a 1 ng/ml, y el 31.8% de recepto­ras con calidad de cuerpo lúteo 2 también registraron concentración de P4 inferior a 1 ng/ml (Cuadro N° 3).
El ritmo de secreción de P4 por parte del cuerpo lúteo es importante por cuan­to permite que exista una sincronización entre el medio intrauterino y el desarro­llo del embrión (12,23). Un aumento prematuro de dicho esteroide durante el metaestro iniciaría un asincronismo entre ambos, similar a la situación que ocurre des­pués de la transferencia de un embrión a una receptora que presentara celo 2 a 3 días antes que la donante (4,12, 24).

Es sabido que la sobrevivencia del embrión transferido es mayor cuando las concentraciones plasmáticas de P4 en el 7º al 8º día del ciclo son moderadas. Si bien no se conocen con exactitud los niveles mínimos que aseguran la viabilidad embrionaria, pueden considerarse adecuadas concentraciones de P4 entre los 2 y 5 ng/ml (12, 13, 14, 16, 18, 19, 20).
En éste estudio los porcentajes de preñez fueron 67.9% y 9.09% para aquellas receptoras con niveles de P4 entre 1 y 5 ng/ml, y menos de 1 ng/ml respectivamente (Cuadros N° 1 y Nº 2).

La bibliografía cita que con una concentración de P4 menor a 2 ng/ml, los porcentajes de preñez oscilan entre el 8.3 al 35.3%, situación que se presenta  en un  21% a 24% de las receptoras (14,18, 19, 20); no estableciéndose preñez alguna con niveles inferiores a 1 ng/ml (16,22). Esto corresponde con nuestros resultados (Cuadros N°1 y Nº 2).
Finalmente los niveles decisivamente altos (más de 6.0 ng/ml) no presentan una correlación positiva con el establecimiento de la preñez (12). Esto puede deberse a una errónea observación del celo, especialmente cuando se maneja un gran número de hembras sincronizadas.
La calidad de los embriones también influye sobre los índices de preñez (2,3). No se establecieron diferencias significativas entre aquellos embriones de calidad excelente y buena, siempre que fueran transferidos a receptoras con P4 superiores a 1 ng/ml; pero si resultaron significativas para receptoras con P4 menores a 1 ng/ml (Cuadro N° 4).


CONCLUSIONES

Reconocemos la utilidad de un test rápido para la determinación de la concentración de P4 en plasma el día de la transferencia, por cuanto:

a) permitirá la selección de receptoras que brindarán mejores y mayores probabilidades de quedar preñadas.
b) permitirá la reutilización de receptoras en breve plazo, con niveles hor­monales inadecuados (hasta 35% sin esperar el retorno al celo o el diagnóstico de vacuidad después de la transferencia.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

l. Mazur, P.; 1980 9th International Congress on Animal Reproduction and A.I., Madrid p. 99.

2. J. F. Hasler; A. D. McCauley; W.F. Lathrop and R.H. Foot: 1987 Theriogenology 27, 139.

3. J. M. Wright,:1985 Theriogenology, 23,17.

4. I. Wilmut; D. I. Sales; C.J. Ashworth: 1985  Theriogenology, 23,107.

5. L. J. De Luca,; E. Capaul; R. Chilan; J. Cuatrin; A. Maciá; M. Miranda; A. Vater: 1985 Proc. X Congreso Panamericano de Vet. y Zootecnia, Buenos Aires, p. 85.

6. De Luca, L; A. Maciá; M. Miranda; G. Iorio y A. Vater: 1988 Vet. Argent, 5, 45.

7. Seidel, J.R; G.E. Seidel and R. Bowen: 1980 Colorado State Univ. Exp. Stm; Gen. Ser. 975, 9.

8. Weaver, D.L. and J. Galland: 1986 J. of Dairy Sci., 69, 2711.

9. Mapletoff, R; C. Lindsell and V. Pawlshyn: 1986 Theriogenology, 25, 172.

10.  Rosenburg, M; Z. Herz; M. Davidson and Y. Folman. 1977J. Reprod. Fert, 51, 363.

11. Wright, J.: 1981 Theriogenology, 15, 143.

12. Britt, J; L. Holt: 1988 Theriogenology, 29, 189.

13. Northey,D; F. Barnes; W. Eyestone and N. First: 1985 Theriogenology, 23, 214.

14. Niemann, H.; B. Sacher and F. Elsaesser: 1985 Theriogenology, 23, 631.

15. Rhodes, R.; R. Randel and C. Long: 1983 J. of An. Sci., 55, 159.

16. Hasler, S.; R. Bowen; L. Nelson and G. Jr. Seidel: 1980 J. Reprod. Fert. 58, 71.

17. De Luca: 1989 Comunicación personal.

18. Bierschwal, C. and C. Murphy: 1985 Embryo Transfer, 1, 37.

19. Remsen, L.; J. Rousell and A. Karihaloo: 1982 Theriogenology, 18, 365.

20. Sunagawa, M.; T. Kasahara; R, Tsunoda and S. Ohtsu: 1987 Jpn J. An. Rep. 33, 206

21. Ayelon, N.: 1978 J. Reprod. Fert. 54, 483.

22. Carou, N.: 1989 Com. Nacional de Energía Atómica, comunicación personal.

23. Hirako, M; T. Kariya; I. Domeki: 1987 Jpn. J. Anim. Reprod. 33 (3), 134.

RESUMEN

El objetivo de ésta experiencia fue evaluar el Elisa test para determinación de progesterona, como un criterio adicional en la selección de receptoras en el momento de la transferencia embrionaria, con la finalidad de incrementar los índices de preñez.


SUMMARY

This experience aim was to evaluate the Progesterone Elisa Test as an aditional screening method for recipients at the embryo transfer time. This method should result in increase of the pregnancy rates.

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24/08/2007

Dalmiro Jimenez Calificar este profesional Tecnologo En Biotecnologia Bovina Tel: 5802767 - Cesar - Colombia Servicios Profesionales Ofrecidos (Contactar)

HOLA COLEGAS, LA PRESENTE ES PARA DECIRLES QUE SI UN CUERPO LUTEO ESTÁ EN LA FASE 1, NO ES POSIBLE SEGUIR CON EL PASO HASTA QUE NO ESTÉ ACTO O SU MADURACIÓN TERMINE. PUEDE SER UN FOLÍCULO DOMINANTE, ES MEJOR UTILIZAR EL ECÓGRAFO. SE DESPIDE ESTE AMIGO Y CONSULTOR, DALMIRO Respuesta Chequeada por Engormix.com

19/12/2007

Francisco Carbajal Chipana Tecnico Agropecuario/distribuidor De Semen Puno - Perú

Me parecen excelentes estos niveles plasmáticos de progesterona receptoras de embriones congelados. Respuesta Chequeada por Engormix.com

17/03/2008

Carlos Madriz Cartago - Costa Rica

Estimado Dr. Da Luca Reciba un cordial saludo, a la vez lo felicito por este excelente aporte, trabajo en trans de embriones y hago ecografía de ovarios, sin embargo siempre he creído que necesitamos en campo un criterio mas para seleccionar receptoras, como el test de P4.En Algunos casos CL de 2.5 cm y la aplicación de un excelente embrión no tienen éxito, probablemente porque en nivel de P4 es 1ng/ml. Tengo dos preguntas: 1- Que factores nutricional o de manejo podrían reducir los niveles de P4 el día de la implantación. 2- Don.de puedo adquirir el test de P4. Gracias Dr. Carlos Madriz Costa Rica Respuesta Chequeada por Engormix.com

18/03/2008

De Luca Leonardo Calificar este profesional Médico Veterinario Tel: 54 - 111558087683 - Buenos Aires - Argentina Servicios Profesionales Ofrecidos (Contactar)

Estimado Carlos Gracias por sus conceptos. La síntesis de progesterona por un cuerpo lúteo nuevo (6 a 12 días) depende fundamentalmente de la incorporación del colesterol a las células pequeñas. Como el colesterol se incorpora con el HDL específicamente la función hepática es importantísima. Vacas o Vaquillas receptoras con leve hepatopatía de tipo distrófica se encuentran incapacitadas para efectuar la síntesis de Lipoproteínas de Alta Densidad. Los animales que ingieren elevada cantidad de proteínas de alta degradabilidad presentan un estado hiperamoniacal el cual interfiere directa (amoníaco) o indirectamente (Calcio iónico) sobre la síntesis de progesterona a nivel enzimático. El Kit usado es el K9 PROGESTERONE VISUAL TEST KIT el cual Usted lo podrá encontrar en internet, en las páginas de Google. Un saludo Leonardo De Luca Respuesta Chequeada por Engormix.com

26/04/2008

Rodolfo Pedroso Sosa Ciudad de la Habana - Cuba

El trabajo presentado muestra la importancia de los niveles de Progesterona previo a la transferencia de embriones en receptoras única observación que hago es , que en el experimento se pudo obtener mucho más información de haber utilizado un análisis estadístico más completo. Este problema ha sido abordado también desde otro punto de vista en estos casos, se han utilizado tratamientos con GnRH o hCG el dia 12 posterior a la transferencia a las receptoras con el fin de potencializar las funciones del cuerpo lúteo. En una investigación realizada con hembras Siboney de Cuba aplicando 500 micrograma de un análogo de los GnRH ( Supergestran /Spofa) se obtuvo una tasa de gestación un 12 % superior a los grupos controles ( 66 % us 44 %). Los rangos de Progesterona plasmática en vacas gestantes estuvieron entre 6 a 7 ng /ml.

26/04/2008

Robinson Rodriguez Huila - Colombia

hola soy estudiante de zootecnia, sus aportes al conocimiento sobre bovinos a sido de gran ayuda para mi, quiero opinar un poco sobre el tema en mension, ademas del uso de medicamentos y las buenas practicas que se utilecen en el trasplante de embriones ,se debe tener encuentra factores medio ambientales que nos afecta el procedimiento, como lo es el clima, el estado de stres del animal ,el espacio entre otros.

27/04/2008

Luis Gulino Calificar este profesional Dr. En Ciencias Veterinarias Tel: 595 21 204322 - Central - Paraguay Servicios Profesionales Ofrecidos (Contactar)

Dr De Luca Antes que nada me parece un articulo muy interesente que puede incidir notoriamente en los resultados de la técnica de implantación de embriones. Me gustaría adquirir el kit de progesterona y encontré que el kit que Ud. menciona es indicado para perras en la determinación de progesterona en suero. Existe otro kit llamado Proges-Check BS indicado para bovinos de la misma compañía. Favor si me puede confirmar cual sería el kit indicado para seleccionar las receptoras, ya que el kit que Ud menciona no corresponde con las indicaciones del fabricante. Atte Dr Luis Gulino Asunción-Paraguay

28/04/2008

De Luca Leonardo Calificar este profesional Médico Veterinario Tel: 54 - 111558087683 - Buenos Aires - Argentina Servicios Profesionales Ofrecidos (Contactar)

Estimado Dr Gulino, el test que Usted indica Proges-Check BS es el indicado. ese es el que Usted debe adquirir ya que dentro de los comerciales es el mas exacto, ademas si Usted realiza las pruebas intraensayos verá que existe poca variabilidad Un gran saludo y que Usted tenga mucha suerte, cualquier inconveniente me escribe Leonardo De Luca

30/04/2008

Freddy Leonet Ing. Agrónomo Monagas - Venezuela

MUY BUENA LA SOLUCION DEL TEMA PERO QUISIERA SAVER EL EFECTO DEL COBRE EN EL CURPO LUTEO O LACTEO Y ENQUE FAVORESE EL P4,TAMBIEN COMO LO PUEDO USAR Y SI DEVO USAR PROGESTERONA EN EL MOMONTO DE LA T.E . YA QUE TENGO MUCHAS DUDAS.GRACIAS. VICTOR ZANCHE

02/05/2008

Rodolfo Pedroso Sosa Ciudad de la Habana - Cuba

La experiencia que tengo en cuanto al uso de cobre inyectable en vacas receptoras de embriones ha sido satisfactoria. Yo le recomiendo usar una dosis de 25 mg/ml previo al tratamiento de sincronización y aplicar 500 microgramos de factor de liberación hormonal el dia de la implantación de los embriones. Por una parte , el cobre ayudaría a la secreción de gonadotróficas luteinizante y por la otra , el tratamiento con los análogos de los factores de liberación hormonal contribuirían a luteinizar los folículos mayores de 10 mm potencializando las funciones del cuerpo lúteo de ciclo.