Influencia del Ambiente Hermético sobre el Crecimiento y Esporulación de Poblaciones Fúngicas Asociadas a Granos de Maíz Almacenados en Silo Bolsa en la Provincia de Buenos Aires, Argentina.

1. INTRODUCCIÓN

En Argentina, el almacenamiento de granos en bolsas plásticas herméticas se convirtió en una herramienta importante para la agricultura por ser un sistema sencillo y de bajo costo. Sin embargo, se requiere del monitoreo frecuente con el fin de detectar precozmente el deterioro de los granos por la micobiota asociada, en particular de poblaciones micotoxigénicas como las de Fusarium spp., Aspergillus spp. y Penicillium spp. aisladas con alta frecuencia en maíces provenientes de silo bolsas de la provincia de Buenos Aires. El deterioro de los granos almacenados por hongos, depende de una serie de factores que pueden clasificarse como intrínsecos, extrínsecos e implícitos (Sinha, 1995). Los factores intrínsecos están relacionados con la composición química y propiedades físicas de los granos (pH, actividad de agua, (aw)) y los factores extrínsecos se asocian con las condiciones de almacenamiento tales como la temperatura, la humedad relativa y la tensión de O2 y CO2. Factores de tipo tecnológicos, como las prácticas de cultivo, también han sido mencionados como determinantes del grado de colonización de las poblaciones (Frazier y Westhoff, 1993).

La germinación de conidios y el crecimiento de las hifas ha sido frecuentemente estudiado en medios nutritivos, ajustados a diferentes aw e incubados a diferentes temperaturas, donde una o varias especies crecen solas o en interacción con otras (Marin et al., 1998a; Abellana et al., 1999). Sin embargo, los resultados obtenidos muchas veces no pueden extrapolarse a situaciones naturales o reales, ya que los sistemas son complejos y en muchas ocasiones las interacciones ocurren en las primeras etapas de la colonización fúngica, donde en algunos casos se originan en microambientes formados por las mismas poblaciones, que favorecidas por las condiciones ambientales presentes, pueden establecerse y crear microclimas que favorecen a otras especies (Wicklow, 1995, citado por Pacin et al., 2009). En otras palabras, los propágulos fúngicos compiten por espacio y nutrientes. La interacción entre las especies depende de la separación inicial de las esporas y de las colonias formadas en la masa de granos (Torres et al., 2003). Por ello, el estudio de los diferentes factores ambientales que se describen en el interior de la bolsa es fundamental para poder entender la ecología de las diferentes especies creciendo solas o con otras (Magan y Lacey, 1988). Si bien se conoce que el almacenamiento en condiciones herméticas genera un cambio en la composición de gases, ocasionado por el metabolismo de los componentes bióticos del granel, no se cuenta con información que permita comprender el comportamiento de las poblaciones fúngicas frente a dichos cambios. Debido a que estos factores podrían afectar el crecimiento de hongos que alteran negativamente la calidad de los granos almacenados e influyen en la producción de micotoxinas, se comprende la relevancia de conocer no solamente la distribución y abundancia de las diferentes poblaciones fúngicas, sino también los factores ambientales que favorecen su desarrollo.

El objetivo del trabajo fue estudiar, in vitro, el crecimiento y esporulación de cepas de F. verticillioides, A. flavus y P. funiculosum aisladas de granos de maíz almacenados en silo bolsas ubicados en el sudeste bonaerense, Argentina.

2. MATERIALES Y MÉTODOS

2.1. Silos bolsa

Se analizaron 540 muestras de granos de maíz obtenidas de cinco silo bolsas ubicados en la zona sudeste de la provincia de Buenos Aires, Argentina (37º45'S - 58º18'W; 130 m sobre el nivel del mar). Los granos fueron embolsados en julio y agosto de 2010 y almacenados durante cinco meses. El contenido medio de humedad de los granos durante la cosecha fue de 16,4% (±0,7). Dentro de cada bolsa se tomaron muestras en tres estratos del perfil vertical a profundidades de 0-0,2 m, 0,2-0,6 m y 0,6-1,8 m y en diferentes zonas que se establecieron a partir del cierre de la bolsa a 10 m distancia entre ellas. Las muestras se recogieron con un muestreador de granos de 1,8 m de largo, en tres tiempos del almacenamiento: al cierre del silo bolsa, después de 90 días y previo a la apertura. Los granos se colocaron en bolsas de papel y se almacenaron a 4 °C hasta su análisis químico y microbiológico que se realizó entre siete y 10 días de recolectados los mismos.

En cada muestreo se registró la temperatura del granel, siendo de 8 °C al momento del embolsado y de 22 °C previo a la apertura de las bolsas.

El aislamiento de hongos filamentosos y levaduras se determinó usando la técnica de diluciones decimales en placas de Petri con agar extracto de levadura cloranfenicol glucosa (YGCA). A partir de sucesivos repiques de las colonias con características morfológicas diferentes, se obtuvieron las cepas puras que se conservaron en glicerol (35% v/v de agua) a -20 °C hasta su identificación (Pitt y Hocking, 1997; Nelson et al., 1983) y posterior caracterización.

2.2. Determinación de las tasas de crecimiento in vitro

Se realizaron dos ensayos, in vitro, para estudiar el efecto de factores extrínsecos (composición de O2 y CO2) e intrínsecos (pH del medio de cultivo) sobre el crecimiento de cepas de tres especies fúngicas aisladas en distintos tiempos del almacenamiento de maíz en silo bolsas. Para el primer ensayo, sin restricciones de oxígeno, se consideraron 39 cepas de A. flavus, 45 cepas de F. verticillioides (especies potenciales productoras de aflatoxinas y fumonisinas, respectivamente) y 32 cepas de P. funiculosum, aislado con alta frecuencia de granos de maíz almacenados en silo bolsa (Castellari et al., 2012). En el segundo ensayo, en condiciones herméticas con ambiente modificado con diferentes composiciones de gases, se consideraron, al azar, 10 cepas de cada una de las especies evaluadas en el primer ensayo.

2.2.1. Aislamientos

Cada aislamiento fue sembrado en placas de Petri de 90 mm de diámetro con medio agar papa glucosa APG 2% (Britania) al que se le adicionó cloranfenicol (Sigma) al 0,02%. Las placas fueron incubadas durante siete días a 25 °C. El micelio y los conidios de cada placa fueron extraídos con 2 mL de una solución de glicerol estéril (35%) y colocados en tubos Eppendorf de 1,5 mL de capacidad y luego conservados en freezer a -20 °C. Cada uno de ellos constituyó el inóculo empleado en todos los experimentos realizados con posterioridad.

2.2.2. Primer ensayo: determinación de la tasa de crecimiento en condiciones óptimas de temperatura, atmósfera y con distinto pH del medio de cultivo

El medio de cultivo base utilizado fue agar papa glucosa 2%, APG (Britania) al que se le incorporó cloranfenicol (Sigma) al 0,02%. Con el objeto de estudiar la influencia del pH sobre la tasa de crecimiento, se ajustó la acidez (usando OHK, 0,01N) a dos niveles: 6,5 que correspondió al pH inicial de los granos de maíz, muestreados al inicio del almacenamiento o cierre de silo bolsa y 5,6 que correspondió al pH final de los granos de maíz muestreados a cinco meses del almacenamiento o previo a la apertura de las bolsas.

Cada aislamiento (conservado en glicerol a -20 °C), fue sembrado por duplicado (en cada medio de cultivo con cada nivel de pH) a razón de 2 ?L de la suspensión de esporas y micelio en el centro de placas de Petri de 90 mm de diámetro. Las placas se incubaron a 25 °C en estufa de cultivo, sin restricción de O2 (atmósfera normal) y diariamente a partir del tercer día y durante siete días se determinó el diámetro de las colonias (mm). Para todas las cepas de cada una de las tres especies estudiadas se procedió con igual protocolo.

2.2.2.1. Análisis de los datos

Los datos se analizaron empleando los paquetes lattice y nlme del programa RStudio (versión 2.15.1), a partir del ajuste modelos flexibles de crecimiento que describieron el cambio del diámetro de las colonias (mm) en el tiempo (día) y en sustratos con distinta acidez (pH). Para analizar el crecimiento de las cepas se ajustaron modelos lineales y polinómicos de distinto orden, incorporando la heterogeneidad de varianza, cuando resultó significativa (Pinheiro et al., 2012).

2.2.3. Segundo ensayo: determinación de la tasa de crecimiento en condiciones restringidas y modificadas de la atmósfera

2.2.3.1. Mezclas de gases

Con el objeto de estudiar el efecto que el cambio de la composición en la atmósfera pudiera ocasionar sobre la tasa de crecimiento de las cepas fúngicas, se diseñaron experimentos considerando mezclas con diferente composición de O2 y CO2. Estos ensayos pretendieron reproducir los cambios en la composición de gases de la atmósfera producidos en el interior de los silo bolsas, generados por la actividad biológica (respiratoria) de los componentes del sistema. Se utilizaron tres mezclas de gases artificiales y la condición de atmósfera normal, resultando en cuatro niveles del tratamiento denominado “composición de gases”. Una de las mezclas correspondió a la concentración de gases que se registró al comienzo del almacenamiento (21% O2 y 0,3% CO2) y otra de las mezclas correspondió a la concentración registrada a los cinco meses de almacenamiento (5% O2 y 15% CO2). Las dos mezclas restantes se consideraron con el objeto de evaluar el efecto de altas concentraciones de CO2 y baja concentración de O2 que típicamente pueden ser registradas en el almacenamiento de granos de maíz, embolsados con un contenido de humedad mayor a 14,5%. La composición de dichas mezclas fue de 25% CO2 y 5% O2 y 25% CO2 y 1% O2, respectivamente. Las mezclas serán denominadas, en adelante, de la siguiente forma: M1: 1% O2 - 25% CO2; M2: 5% O2 - 25% CO2; M3: 5% O2 - 15% CO2; M4: 21% O2 – 0,3% CO2.

Las mezclas M1, M2 y M3 fueron adquiridas a la Empresa Air Liquide Argentina S.A. en cilindros de aluminio de un litro de capacidad (volumen de agua), conteniendo cada mezcla controlada compuesta, con balance nitrógeno. El regulador utilizado fue un regulador Alphagaz, cuerpo inoxidable y presión salida de 0 a 8 bar.

2.2.3.2. Unidades experimentales

Para la evaluación de las atmósferas donde crecieron las cepas fúngicas, se diseñaron frascos herméticos de vidrio trasparente, de capacidad 1,550 cm3 con tapa plástica de cierre a rosca. A la tapa se le practicó un orificio en el cual se colocó un septo de goma, que constituyó el punto por donde se inyectó el gas y/o extrajo la muestra con posterioridad a la incubación para monitorear y controlar su concentración.

Cada frasco presentó una capacidad para albergar 20 placas de Petri plásticas de 40 mm de diámetro, conteniendo la cepa a evaluar.

Para inyectar la mezcla de gases se utilizó la técnica de vacío, empleando una bomba de vacío DVL 150, de vacío máximo 0,030 mm Hg; desplazamiento 50 Hz – 150 L/min. La presión de trabajo de vacío fue de 68 mm Hg/min y el tiempo para lograr el vacío fue de 2 min. La presión de trabajo de llenado con la mezcla fue de 5 L/min, logrando el llenado con 4 min de trabajo, aproximadamente. Para lograr la hermeticidad luego del llenado se utilizó sellador universal de silicona 3M en el septo.

En el caso de la M4 (21% O2 - 0% CO2) el frasco fue acondicionado empleando igual metodología que la utilizada para las mezclas M1, M2 y M3 y luego de lograda la hermeticidad se midió la concentración de gases.

2.2.3.3. Las cepas

Para los ensayos de evaluación de la influencia de la composición de gases del ambiente y del pH del medio sobre el crecimiento de las tres especies, se seleccionaron al azar 10 cepas de cada una de ellas, considerando que en el primer ensayo (evaluación de la tasa de crecimiento) no se detectó efecto de la cepa.

2.2.3.4. Diseño del experimento

Se evaluaron al azar 10 cepas de cada especie. Alícuotas de 2 ?L de cada suspensión de esporas y micelio, se sembraron en el centro de cada placa de Petri de 40 mm de diámetro, con medio de cultivo APG (2%) con cloranfenicol (0,02%) y con dos niveles de pH (5,6 y 6,5).

Cada aislamiento se sembró en ocho placas (cuatro por cada nivel de pH, considerando dos lecturas que correspondieron a tres y siete días). Las placas fueron colocadas dentro de los frascos, a razón de 20 placas por frasco (10 cepas) y al azar en cuanto a posición de las mismas en el interior del frasco.

Debido a que para determinar los diámetros de las colonias a los tres y siete días de incubación, fue necesario abrir los frascos para extraer las placas, se confeccionaron el doble de frascos (muestreo destructivo).

En la siguiente etapa se inyectó la mezcla de gas y lograda la composición de los gases en el interior de los frascos, éstos se colocaron en estufa de cultivo y se incubaron a 25 °C. A los tres y siete días los frascos fueron retirados de la estufa, se midió la concentración de los gases de su interior, empleando un medidor de gases portátil (Check Point, PBI, Dan Sensor, Dinamarca) y posteriormente se abrieron para extraer las placas y registrar los diámetros de las colonias desarrolladas.

2.2.3.5. Análisis de los datos

Los datos fueron analizados empleando el paquete Rcmder del programa R (versión 2.15.1). Se realizó un análisis de la varianza (ANOVA) considerando el efecto de la mezcla de gases y el pH sobre la variable evaluada “diámetro de las colonias”. Una vez determinada la significancia del efecto de cada factor sobre la variable, se realizó un test de comparaciones múltiples (Tukey, 5%) a través del paquete agricolae del software estadístico R (2.15.1).

2.2.4. Estudio de la esporulación de cepas

Con el objeto de estudiar el efecto que pudieran ocasionar sobre la esporulación, el pH del medio de cultivo y la composición de gases de la atmósfera, se realizó el recuento de conidios (cm2)-1 de las colonias de cinco de las 10 cepas, al azar, desarrolladas luego de registrados los diámetros de las mismas, a los siete días de incubación. Se efectuaron, de cada lectura, tres repeticiones.

El protocolo consistió en extraer de cada colonia tres discos a una distancia de 5 mm desde el centro de la misma, con un sacabocados de 4 mm de diámetro. Los tres discos de la colonia fueron colocados en un tubo Eppendorf conteniendo 1 mL de una solución de NaCl (0,8%). Los tubos se agitaron durante 30 segundos en vortex y luego se registró el recuento de conidios en cámara de Neubauer.
Para la expresión de los resultados se consideró la superficie total que representaron los tres discos de cada colonia, resultando en 3,75 cm2 (r2=4; π=13,1416; 3 discos). Los recuentos se expresaron en número de conidios (cm2)-1.

2.2.4.1. Análisis de los datos

Los datos fueron analizados empleando el paquete Rcmder del programa R (versión 2.15.1). Se realizó un análisis de la varianza (ANOVA) considerando el efecto de la mezcla de gases y el pH sobre el número de conidios (cm2)-1. Una vez determinada la significancia del efecto de cada factor sobre la variable, se realizó un test de comparaciones múltiples (Tukey, 5%) a través del paquete agricolae del software estadístico R (2.15.1).

3. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

3.1. Primer ensayo: determinación de la tasa de crecimiento en condiciones óptimas de temperatura, atmósfera (sin restricción de O2) y con distinto pH del sustrato El crecimiento de las especies fúngicas ha sido estudiado considerando que su forma visible es través del desarrollo de colonias en la superficie del sustrato y consecuentemente, éste se expresa como diámetro o radio de la colonia en el tiempo. En muchos casos el diámetro de la colonia fue utilizado considerando diferentes condiciones de crecimiento y luego modelados.

En este trabajo, para analizar el crecimiento de las cepas de A. flavus, se ajustó un modelo polinómico de sexto orden, que resultó significativo (p<0,001), en el caso de F. verticillioides se ajustó un modelo polinómico de segundo orden y para P. funiculosum se ajustó un modelo lineal que resultó significativo (p<0,001) para explicar el crecimiento en las condiciones evaluadas.

3.1.1. A. flavus En la Tabla 1 se presentan los diámetros de las colonias desarrolladas durante siete días y la evolución del crecimiento, para los dos niveles de acidez estudiados, sin restricciones de O2 y con temperatura óptima de crecimiento (25 ºC). No se detectó interacción significativa entre pH y tiempo (p=0,05857) pero sí efecto de los factores puros, tiempo (p<0,001) y pH (p<0,001). El diámetro de las colonias se incrementó diariamente durante los siete días y el medio de cultivo con menor acidez favoreció el desarrollo de las colonias, registrando para el pH 6,5 los mayores diámetros.

Tabla 1. Evolución del diámetro de las colonias de cepas de A. flavus desarrolladas en APG durante siete días.

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*Medias acompañadas de letras distintas, dentro de cada pH indican diferencias significativas entre tiempos (p<0,05).

3.1.2. F. verticillioides La caracterización del crecimiento diario de las cepas de F. verticillioides en sustratos con distinto pH se presentan en la Tabla 2.

Tabla 2. Evolución del diámetro de las colonias de cepas de F. verticillioides desarrolladas en APG durante siete días.

*Medias acompañadas de letras iguales, dentro de cada pH, no difieren significativamente entre días (p>0,05).

Se detectó interacción significativa entre pH y tiempo (p=0,0117). El análisis de la comparación de las medias mostró que para ambos niveles de pH los diámetros no se incrementaron significativamente a partir del sexto día.

Considerando los siete días de desarrollo de las colonias, los resultados del análisis mostraron que en las primeras 48h los diámetros de las colonias no presentaron diferencias significativas (p>0,05) respecto de los dos niveles de pH. A partir del tercer día, el diámetro de las colonias fue siempre significativamente mayor (p<0,05) para las colonias desarrolladas en APG con pH 6,5.

3.1.3. P. funiculosum La caracterización del comportamiento del crecimiento de las cepas de P. funiculosum se presenta en la Tabla 3.

Tabla 3. Evolución del diámetro de las colonias de cepas de P. funiculosum desarrolladas en APG durante siete días.

*Medias acompañadas de letras distintas, dentro de cada pH, difieren significativamente (p<0,05) entre días.

Luego de analizados los factores del modelo y realizado el análisis de la varianza, no se detectó interacción significativa entre pH y tiempo (p=0,9979), ni efecto de pH (p=0,1478). Sólo se detectó efecto del factor tiempo (p<0,001).

Los resultados de las comparaciones de las medias mostraron que para ambos niveles de pH los diámetros se incrementaron significativamente entre el primer y séptimo día de evaluación. Claramente pudo observarse que A. flavus presentó, en condiciones no limitantes de O2, los mayores diámetros. Por otro lado, el pH del medio de cultivo influyó en el tamaño de las colonias de A. flavus y F. verticillioides, para las cuales se determinó que el pH 6,5 (que coincidió con el pH de los granos al inicio del almacenamiento) favoreció los mayores diámetros. Las cepas de Fusarium presentaron un comportamiento diferente respecto de las cepas de Penicillium sp. con referencia al pH del medio de cultivo. Cuando el pH fue de 5,6 el tamaño de las colonias de F. verticillioides fue menor a los siete días. Sin embargo, cuando el pH fue de 6,5 las colonias de F. verticillioides presentaron mayor diámetro a los siete días. El medio con pH 5,6 que representó la acidez registrada en los granos de maíz al final del período de almacenamiento, pudo haber sido la causa de los menores recuentos y menor frecuencia de aislamiento detectada para F. verticillioides.

3.2. Segundo ensayo: Efecto de atmósferas con diferente composición de O2 y CO2 en el crecimiento y esporulación

3.2.1. A. flavus

En la Tabla 4 se presentan los tamaños de las colonias desarrolladas a los siete días de incubación en medios con distinta acidez y atmósferas con distinta composición de gases.

Como puede observarse, la mayor concentración de CO2 (25%) influyó negativamente en el tamaño de las colonias, registrándose significativamente (p<0,01), los menores diámetros. Por otro lado, el pH afectó el diámetro de las colonias, registrándose para el sustrato con pH 6,5 (excepto para la M3) significativamente (p<0,01) los mayores tamaños de las colonias a los siete días, respecto de aquellas crecidas en sustrato con pH 5,6.

Tabla 4. Diámetro de colonias (mm) desarrolladas a los siete días en medio de cultivo con distinta acidez y ambientes herméticos con distinta composición de gases.

M: mezclas O2-CO2. M1: 1-25%; M2: 5-25%; M3:5-15%; M4: 21-0,3%;

*Medias acompañadas de letras diferentes dentro de cada fila (composición de gases), indican diferencias significativas (p<0,05) entre pH.

Si consideramos el desarrollo de las cepas en condiciones normales de O2, sin restricciones, respecto de la misma composición inicial de gases pero en ambiente hermético, se determinó que las colonias redujeron sus tamaños, en un 52 y 46% para aquellas desarrolladas en pH 5,6 y 6,5 respectivamente (Tabla 1), a los siete días de incubación.

Al analizar las variables pH y composición de gases del ambiente de crecimiento, no se detectó efecto de interacción pH y mezcla (p=0,3189), pero sí efecto puro de ambos factores (pH y mezcla de gases: p<0,00001). La mayor concentración de O2, favoreció un mayor tamaño de las colonias. Por otro lado, pudo inferirse que a una misma concentración de O2 el incremento en la concentración de CO2 de 15 a 25%, redujo el tamaño de las colonias. Luego de observar que a una misma concentración de CO2 (25%) pero menor concentración de O2 (1%) el tamaño de la colonia fue mayor y diferente a lo esperado, se resolvió registrar la esporulación de las colonias. Se determinó que aquellas cepas desarrolladas con la misma concentración de CO2 pero menor concentración de O2, presentaban un diámetro mayor, con escasa esporulación, a diferencia de aquellas desarrolladas con mayor concentración de O2 cuyo tamaño fue menor a los siete días, pero la esporulación fue importante.

En la Tabla 5 se presentan las medias del número de conidios (log10 cm2)-1. No se detectó efecto significativo de la interacción pH y mezcla de gases (p=0,1252), ni efecto del pH (p=0,1992), pero sí de la composición de gases (p<0,00001) en el recuento de conidios.

Tabla 5. Esporulación de cepas de A. flavus en ambientes herméticos con diferente composición de gases.

Medias acompañadas de letras iguales no difieren significativamente entre las mezclas de gases al 5%.

M: mezclas, O2-CO2. M1: 1-25%; M2: 5-25%; M3:5-15%; M4: 21-0,3%; TSR: testigo sin restricción de O2; ND: no detectada.

Puede apreciarse claramente que el menor contenido de O2 en el ambiente (1%) afectó significativamente el número de conidios, registrándose valores de cuatro órdenes menores a los registrados con niveles de O2 mayores de 5%.

3.2.2. F. verticillioides

En la Tabla 6 se presentan los tamaños de las colonias desarrolladas a siete días de incubación en medio de cultivo con distinta acidez, bajo atmósferas con diferente composición de gases.

Tabla 6. Diámetro de colonias (mm) de cepas de F. verticillioides desarrolladas a los siete días en medio de cultivo con distinta acidez, bajo atmósferas con diferente composición de gases.

M: mezclas O2-CO2. M1: 1-25%; M2: 5-25%; M3:5-15%; M4: 21-0,3%;

*Medias acompañadas de letras diferentes dentro de cada fila (composición de gases), indican diferencias significativas (p<0,05) entre pH.

Al analizar las variables pH y composición de gases del ambiente hermético de crecimiento, no se detectó efecto de interacción pH y mezcla (p=0,132), pero sí efecto puro de ambos factores (pH: p=0,01005 y mezcla de gases: p<0,0000001).

La mayor concentración de CO2 (25%) acompañada de 1% de O2 influyó negativamente en el tamaño de las colonias. Contrariamente, la mayor concentración inicial de O2 y menor de CO2, favoreció el desarrollo de las colonias, determinando para este ambiente, los mayores diámetros. Respecto de las colonias desarrolladas en el ambiente M3, los diámetros fueron significativamente menores (p<0,001) respecto de M2. Este resultado llevó a presumir sobre la posibilidad de que existió un comportamiento diferencial de las cepas respecto del crecimiento o la esporulación.

Al realizar las comparaciones de las medias de los diámetros considerando el efecto del pH, dentro de cada mezcla de gases (Tukey 5%) se determinó que los tamaños de las colonias desarrolladas en sustratos con pH 6,5 para las composiciones M1 y M3 fueron significativamente mayores a aquellas crecidas en sustrato con pH más ácido (5,6); mientras que para las composiciones M2 y M4 no se registraron diferencias en el tamaño en sustratos con diferente acidez.

Si consideramos el desarrollo de las cepas en el ambiente hermético M4 en comparación con el tamaño logrado por las mismas cepas en condiciones sin restricción de O2 se determinó que las colonias redujeron sus tamaños finales, en un 27 y 48% para aquellas desarrolladas en medio de cultivos con pH 5,6 y 6,5 respectivamente (Tabla 2), a los siete días de incubación.

Luego de observar que a una misma concentración de O2 (5%) y menor concentración de CO2 (15%) el tamaño de la colonia fue menor respecto de aquella con 25% de CO2 y diferente a lo esperado, se resolvió registrar la esporulación de las colonias, como ocurrió para A. flavus. Se determinó que aquellas cepas desarrolladas con la misma concentración de O2 pero menor concentración de CO2, presentaron un diámetro menor, con mayor esporulación, a diferencia de aquellas desarrolladas con mayor concentración de CO2.

El análisis de la varianza (Tabla 7) que consideró como variables independientes el pH, la composición de gases y la interacción de ambos, sobre el número de conidios (log10 cm2)-1 no detectó efecto significativo de la interacción pH y mezcla de gases (p=0,7521), ni efecto del pH (p=0,3190), pero sí se determinó efecto puro de la composición de gases (p<0,00001).

Tabla 7. Esporulación de cepas de F. verticillioides en ambientes herméticos con diferente composición de gases y en medio de cultivo con distinto pH.

Media*: solo considerando el efecto de la composición de gases.

Medias acompañadas de letras diferentes indican diferencias significativas entre las mezclas de gases al 5%.

M: mezclas, O2-CO2. M1: 1-25%; M2: 5-25%; M3:5-15%; M4: 21-0,3%; TSR: testigo sin restricción de O2.

Puede apreciarse claramente que la condición de hermeticidad redujo la esporulación.

3.2.3. P. funiculosum

En la Tabla 8 se presentan los tamaños de las colonias desarrolladas a siete días de incubación en ambientes con diferente composición de O2 y CO2, en sustratos con distinta acidez.

Tabla 8. Diámetro de colonias (mm) de cepas de P. funiculosum desarrolladas a los siete días en ambientes herméticos con distinta composición de gases, en medio de cultivo con distinta acidez.

M: mezclas O2-CO2. M1: 1-25%; M2: 5-25%; M3:5-15%; M4: 21-0,3%; *Medias acompañadas de letras iguales dentro de cada fila (composición de gases), indican la inexistencia de diferencias significativas (p<0,05) entre pH.

Al analizar las variables pH y composición de gases del ambiente hermético de crecimiento, no se detectó efecto de interacción pH y mezcla (p=0,9461), ni efecto puro del factor pH (p=0,4247), pero sí se detectó efecto del factor mezcla de gases (p<0,00001). Se observó que la mayor concentración de CO2 (25%) acompañada de 1% de O2 influyó negativamente en el tamaño de las colonias, registrándose significativamente (p<0,01), los menores diámetros. Contrariamente, la mayor concentración inicial de O2 y menor de CO2, favoreció el desarrollo de las colonias, determinando para este ambiente, los mayores diámetros.

Cómo se reportó para A. flavus y F. verticillioides el crecimiento en un ambiente hermético redujo el tamaño de las colonias de las cepas de P. funiculosum en un 58,5 y 49,4% para aquellas desarrolladas en medio de cultivos con pH 5,6 y 6,5 respectivamente (Tabla 3), a los siete días de incubación. Respecto de las colonias desarrolladas en los ambientes con M2 y M3, si bien no se detectaron diferencias significativas entre los diámetros, se observó para ambos niveles de pH que los valores de las colonias desarrolladas en el ambiente con 25% de CO2 fueron mayores. A partir de estos resultados también se planteó la necesidad de estudiar la esporulación de las colonias ya que los menores diámetros obtenidos en M3 respecto de M2 podrían estar relacionados con una mayor esporulación, como posible estrategia de supervivencia. El análisis del efecto de los factores pH, composición de gases e interacción de ambos sobre la esporulación, no detectó efecto significativo de la interacción pH y composición de gases (p=0,9572), ni efecto del pH (p=0,5742), pero sí de la composición de gases (p<0,00001) y los resultados se presentan en la Tabla 9.

Tabla 9. Esporulación de cepas de P. funiculosum en ambientes herméticos con diferente composición de gases.

Medias acompañadas de letras iguales indican que no difieren entre las mezclas de gases, al 5%. M: mezclas, O2-CO2. M1: 1-25%; M2: 5-25%; M3:5-15%; M4: 21-0,3%; TSR: testigo sin restricción de O2.

En el caso de P. funiculosum, al igual que en A. flavus y F. verticillioides, la reducción del O2 inicial del ambiente de crecimiento afectó negativamente la esporulación. Sin embargo, la sola condición de hermeticidad del ambiente no afectó la esporulación, ya que no se detectaron diferencias significativas entre TSR, M4 y M3. El incremento de la concentración inicial de CO2 podría estar afectando la esporulación, reduciendo el recuento de conidios en P. funiculosum respecto de las otras dos especies evaluadas. Los mayores recuentos de conidios se determinaron en ambientes con concentración de O2 igual o mayor a 5% y concentración de CO2 igual o menor a 15%. Los resultados presentados en este estudios aportan información que sustenta los reportes realizados sobre la presencia y abundancia de Aspergillus spp., Fusarium spp. y Penicillium spp., que constituyen la micobiota principal que coloniza y se establece en los granos de maíz almacenados en silo bolsas, por periodos que alcanzan los cinco meses (Castellari et al., 2012; Castellari et al., 2010). La estructura de la micobiota es dinámica e influida por el ambiente. La presencia de especies micotoxigénicas en el almacenamiento hermético obliga a realizar controles periódicos respecto de la integridad física de los silos bolsa y de la actividad metabólica de los componentes del granel (monitoreo de la concentración de CO2 y O2), debido a que los inóculos de estas especies posibilitarían la ocurrencia de micotoxinas.

4. CONCLUSIONES

El crecimiento y la esporulación de cepas de A. flavus, F. verticillioides y P. funiculosum fueron afectados por el ambiente generado durante el almacenamiento hermético de granos de maíz. La disminución del O2, el incremento del CO2 y el aumento de la acidez, redujeron el diámetro de las colonias, aunque de manera diferente según la especie. Por otro lado, la reducción del O2 afectó negativamente la producción de conidios.
A partir de los resultados obtenidos en el presente trabajo, se sugiere que concentraciones de 25% de CO2 y 1% de O2 deberían ser consideradas para diseñar prácticas de manejo tendientes a lograr en el interior de las bolsas un ambiente desfavorable que condicionará la sobrevivencia de los hongos que deterioran la calidad higiénico-sanitaria de los granos.

5. BIBLIOGRAFÍA

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