FluoroQuant® Afla Plus test kit para el análisis de aflatoxinas
FluoroQuant® Afla Plus Test Kit para aflatoxinas, Concesión del StatusAOAC: Performance TestedSM
Las aflatoxinas son un grupo de compuestos químicamente relacionados, que son importantes micotoxinas hepatotóxicas. Son producidas por hongos que pueden contaminar varios cultivos importantes incluyendo maíz, maní y nueces, cuando las condiciones ambientales son las adecuadas.
Estas toxinas pueden provocar enfermedades hepáticas en humanos y animales, además de detrimento de la producción de leche y huevos; además son inmunosupresivas, carcinogénicas y mutagénicas.
La aflatoxina que ocurre con mayor frecuencia es Aflatoxina B1. Los principales hongos asociados con la producción de aflatoxinas son Aspergillus flavus y Aspergillus parasiticus, siendo ésteúltimo de particular importancia en la contaminación del maní. Las temperaturas cálidas y las condiciones de sequía provocan que los granos estén más susceptibles a la formación de aflatoxinas en el campo. Además los daños por insectos permiten a los organismos a acceder a los granos individuales, incrementando así la chance de contaminación con aflatoxinas en un cultivo infestado. Además, las toxinas pueden formarse bajo condiciones pobres de almacenaje en las que los granos se exponen a altas temperaturas y humedades ambientales o han sido inadecuadamente secados y acondicionados.
Figura 1: Estructura de la aflatoxina B1.
La concentración de aflatoxinas, típicamente se cuantifica utilizando tecnología ELISA, HPLC o pruebas fluorométricas.
La tecnología ELISA, frecuentemente requiere largos tiempos de incubación, habilidosos analistas y habitualmente se utiliza cuando se disponen para analizar grupos de muestras en lugar de muestras. HPLC requiere equipamiento costoso y analistas altamente entrenados. Además, muchos de los métodos HPLC aprobados o utilizados en estudios colaborativos, precisan de grandes volúmenes de muestras a purificar o prolongados tiempos de análisis. Los métodos fluorométricos tienen las ventajas de velocidad, simplicidad en el uso y la capacidad de aplicarse a muestras individuales. Éstas, son cualidades altamente deseables en un ambiente donde muestras individuales o pequeños grupos de muestras deben ser analizadas rápidamente.
FluoroQuant® Afla Plus es un método fluorométrico mejorado y que cuenta con la concesión del Status AOAC: Performance TestedTM.
Este kit emplea un paso simple de clean-up, utilizando para ello una columna de fase sólida, seguido por un análisis fluorométrico para determinar aflatoxinas en maíz, almendras y maní. Para la extracción se utiliza acetonitrilo/agua o metanol/agua (opcional para maní). Este método cuantitativo es rápido, exacto, económico y puede ser aplicado a muestras individuales. Es lo suficientemente simple para ser utilizado en plantas de recepción y acondicionamiento de granos, alimentos para consumo y raciones, así como en terminales de exportación. Pero también puede emplearse en laboratorios analíticos.
Es un método muy simple. Primero se colecta una muestra, asegurando la representatividad del lote a ser analizado. Se muele la muestra, y una porción de 50 g se dispone una jarra para licuadora. Maíz, maní y almendras se extraen con 84/16 acetonitrilo/agua. Opcionalmente, para maní puede utilizarse una mezcla 80/20 de metanol/agua en reemplazo del acetonitrilo/agua.
Licuar la muestra durante 30 segundos (para maíz) o 1 minuto (para almendras y maní) y filtrar en un contenedor de vidrio o polipropileno. Tomar 2 mL de este extracto y colocarlo en una columna de cleanup SolSep® 2001, incluida en el FluoroQuant® Afla Plus test kit. Si se utiliza metanol para la extracción, en el caso de maní, las muestras deben licuarse durante 3 minutos.
Luego de la extracción, agregar 1 mL de extracto de la muestra y 1 mL de diluyente en la columna y mezclar con la punta de la pipeta. Luego se pasa la muestra a través de la columna utilizando presión positiva, y se toma 1 mL del extracto purificado y se lo dispone una cubeta limpia. Se agrega 1 mL de revelador, se mezcla utilizando un vortex, y se coloca la cubeta en el flurómetro calibrado. El fluorómetro presenta un resultado en ppb luego del retardo programado. Este método es muy rápido, y puede llevarse a cabo en 5 minutos o menos incluyendo el paso de extracción.
Programas de Validación de Métodos AOAC
AOAC ofrece tres programas para la validación de métodos– El AOAC Official MethodsSM, Peer-Verified Methods- SM, y Performance TestedSM Methods.
El programa AOAC Official MethodsSM valida y aprueba métodos propietarios y no-propietarios. Un método aprobado bajo este programa ha sido probado utilizando un extenso estudio colaborativo multi-laboratorio, usando al menos de 8 a 10 laboratorios independientes. Existen dos Official Methods que utilizan productos Romer Labs® para la detección de aflatoxinas: method 994.08 (“Aflatoxins in Corn, Almonds, Peanuts, Brazil Nuts, and Pistachio Nuts”), que es un método HPLC que emplea columnas MycoSep® 224, y 993.16 (“Total Aflatoxins (B1, B2, and G1) in Corn”), el método AflaCup 20.
El programa Peer-Verified MethodsSM provee una validación independiente por una tercera parte para métodos no-propietarios. Estos métodos no han pasado por un estudio colaborativo completo, pero se ha verificado su funcionamiento en al menos un laboratorio independiente.
Este programa puede ser un punto de partida para el programa Official MethodsSM, dado que algunos de estos métodos, eventualmente se someten a estudios colaborativos completos.
El programa Performance Tested MethodsSM es administrado por el AOAC Research Institute, una subsidiaria de AOAC International. Este programa proporciona una validación independiente por una tercera parte para un método comercial propietario (test kit). El desempeño de estos métodos ha sido verificado en al menos un laboratorio independiente. El Estatus Performance Tested MethodsSM asegura a los usuarios finales que el test kit ha sido validado por una tercera parte y el desempeño es el adecuado a la demanda. Una declaración que el kit no ha sufrido cambios se envía a AOAC anualmente cuando la aprobación es renovada. Si el kit ha cambiado, debe notificarse a AOAC del cambio y se requerirán pruebas adicionales. Este programa puede ser un punto de partida para el programa Official MethodsSM, dado que algunos de estos métodos, eventualmente se someten a estudios colaborativos completos.
El FluoroQuant® Afla Plus test kit para el análisis de aflatoxinas fue aprobado como Performance Tested Method en marzo de 2007.
Estatus AOAC: Performance TestedSM
La prueba de desempeño de un test llevada a cabo por una organización internacional independiente, otorga la confianza a los consumidores de que el producto a sido evaluado y conformadas sus demandas para el funcionamiento. El Instituto de Investigación AOAC es una organización científica, sin fines de lucro que provee reconocidas pruebas de desempeño de métodos analíticos.
Actúan como terceras partes independientes, y conceden el Estatus Performance TestedSM a aquellos test kits que son evaluados y conforman sus requerimientos y demandas. Para obtener el estatus Performance TestedSM, Romer Labs® ha llevado a cabo un estudio de validación interno, y se remitió un reporte de validación de soporte al desempeño del FluoroQuant® Afla Plus test kits demandado por el Referee General, quien es un experto en el análisis de micotoxinas. El Referee General distribuye el reporte a un panel de expertos internacionales para la revisión.
Luego se envían los kits a un laboratorio analítico independiente, aprobado por AOAC-RI, para la evaluación. Entonces, el Referee General y el panel de expertos revisan el reporte de validación y los resultados obtenidos por el laboratorio independiente antes de conceder al kit el Estatus: “Performance TestedTM”.
Validación de FluoroQuant® Afla Plus
A fin de verificar el desempeño del kit, Romer Labs® condujo un estudio de validación en el cual fueron analizadas muestras naturalmente contaminadas y fortificadas de maíz, almendras y maní, con diferentes lotes del kit y a largo de períodos de varios días. Los resultados se compararon con un método de referencia HPLC. Además se evaluaron la estabilidad y robustez del kit.
Para determinar el LOD, 10 muestras “no detectables” de cada producto fueron extraídas y analizadas de acuerdo al método del test kit. El LOD se determinó como el valor medio más dos desvíos estándares. El LOD varió entre cada matriz, y se determinó el valor de 1,9 para todos los productos probados, tal como se muestra en la tabla 1.
Para evaluar la exactitud y precisión del test kit, muestras de maíz naturalmente contaminadas y muestras fortificadas de maíz, maní y almendras fueron analizadas de acuerdo con el método del test kit.
Veintiuna muestras de maíz naturalmente contaminadas fueron extraídas y analizadas para cada aflatoxina individualmente, por tres analistas que desconocían el nivel de contaminación con el analito. Además, cinco réplicas de cada nivel de maíz, maní y almendras fortificados fueron analizados por tres analistas utilizando el kit.
El kit demostró un muy buen desempeño con el maíz naturalmente contaminado con aflatoxinas dentro del rango que va desde no detectable a 100 ppb. Todos los resultados promedios se encontraron en rangos aceptables a un nivel de confianza del 95 % del resultado individual para cada rango.
Los resultados del test kit correlacionaron bien con los resultados obtenidos con el método HPLC.
La recuperación para las muestras fortificadas fue de 84 – 92%. El kit también tuvo muy buen desempeño en maní y almendras fortificados con aflatoxinas.
Todos los resultados medios y se obtuvieron en rangos aceptables y el 100% de los resultados individuales también se encontraron dentro de los rangos aceptables.
La recuperación para las muestras fortificadas varió entre 85– 115%. La incertidumbre de la medición para maíz se evaluó en ±2 ppb a 5 ppb, ±5 ppb a 10 ppb, ±6 ppb a 20 ppb, y ±21 ppb a 100 ppb en un intervalo de confianza del 95%.
El kit fue evaluado también para determinar la robustez y estabilidad. El kit demostró buenos resultados a varias temperaturas ambientales, tiempos de extracción, antigüedad del extracto, tiempo de cleanup y antigüedad del revelador.
Tabla 1: LOD de los productos validados
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Tabla 2: Maíz naturalmente contaminado – Análisis por laboratorios independientes
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Tabla 3: Maní crudo sin blanquear, maní crudo blanqueado, almendras crudas. Fortificados
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Tabla 4: Datos de recuperación
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Conclusiones Los datos brindados por laboratorios independientes mostraron que los resultados obtenidos utilizando un método HPLC oficial AOAC y el FluoroQuant® Afla Plus test kit se correlacionan muy bien unos con otros. Además los resultados obtenidos en la validación interna, mostraron que el kit concuerda con el HPLC, con muy buena recuperación para aflatoxinas, buen desempeño a los límites de cuantificación, así como estabilidad y robustez bajo diferentes condiciones de operación, como las que deberían esperarse con el empleo del kit a campo. El kit es rápido y fácil de operar, brindando resultados cuantitativos en menos de 5 minutos. Esto es adecuado para su uso en plantas procesadoras de granos, raciones y alimentos así como en terminales de exportadores y laboratorios analíticos. |
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