Explorar
Comunidades en español
Anunciar en Engormix

Análisis para el Control de Micotoxinas

Publicado: 9 de junio de 2015
Por: Javier Lara Arellano, Ph.D. Nutek S.A. de C.V. Investigación Aplicada S.A. de C.V. México
Introducción.
Los granos constituyen un porcentaje muy importante de las raciones. En el caso especial de México y de otros países, el origen de la mayor parte de los granos es de importación.  Se estima, por ejemplo, que del total de toneladas de granos utilizadas en la producción pecuaria aproximadamente el 60%  o más de ellas son de importación.
Por otra parte, la mayor incidencia de problemas de productividad asociados a la compra de granos donde no se consideran las micotoxinas, ha hecho que la industria pecuaria esté conciente de la problemática de las micotoxinas. Esto ha hecho que la industria establezca programas de manejo adecuado de granos que abarcan desde la elaboración de un buen contrato de compra en el cual se limita la contaminación con micotoxinas hasta un control de calidad de ellos.
Para implementar estos programas, ha sido necesario que los laboratorios de control se mantengan actualizados considerando la implementación y validación de métodos analíticos para los diferentes insumos y micotoxinas, la rapidez en la respuesta y exactitud de los análisis de granos, la asesoría sobre el cuidado de los granos y los efectos tóxicos de las micotoxinas en la producción pecuaria y el soporte técnico en la compra de granos que incluye la supervisión del embarque.
 
Análisis de Micotoxinas.
Como se intuye, el análisis de micotoxinas hace su aparición en el proceso productivo pecuario cuando empieza el almacenamiento de los granos. Y aquí, es donde realmente comienza la responsabilidad de la industria pecuaria. Se debe comprar grano de buena calidad y evitar así que el insumo contaminado llegue a los animales. Además se debe tener un programa adecuado de manejo de materiales para disminuir la posibilidad de que el grano y el alimento lleguen a contaminarse. Dentro de este programa es importante contar con métodos de análisis químico que sean confiables. Por consiguiente, el análisis de las micotoxinas adquiere una gran importancia, pues cualquier acción a tomar, ya sea una reclamación al vendedor de granos o una modificación en la dieta o manejo, está fundamentada en el valor reportado por el laboratorio.
Para el análisis de micotoxinas existen diferentes métodos que pueden ser utilizados pero la selección siempre se debe basar en que el método a utilizar sea confiable,  aplicable y práctico (Horwitz 1982). La confiabilidad  se refiere a su exactitud en la determinación y a su variabilidad o precisión y es el parámetro más importante a considerar desde el punto de vista analítico. Además es necesario que el método se aplique a una variedad amplia de muestras y que sea práctico con respecto al costo, tiempo de análisis y capacitación para su realización. Por consiguiente, es importante considerar si el método seleccionado es válido para el tipo de muestra a analizar, ya que no es lo mismo analizar maíz o sorgo que alimento terminado o ensilado pues las propiedades fisicoquímicas son diferentes.
La determinación de micotoxinas no es algo simple, dado que ellas se encuentran distribuidas de manera heterogénea en el insumo. Sin embargo, de manera simple, el análisis puede dividirse en tres etapas importantes a saber: (1) la toma de la muestra en el lote, (2) molienda de la muestra y toma de la submuestra y (3) extracción y cuantificación de la micotoxina. De esta manera cuando se reporta un resultado de análisis de micotoxinas éste puede ser representado por la siguiente expresión:
C = VR + EM +ES +EA 
Donde:
C: valor reportado por el laboratorio.
VR: valor real del lote.
EM: error cometido por el muestreo.
ES: error cometido por el submuestreo.
EA: error debido al método de análisis químico.
Se ha demostrado que en el caso del análisis de micotoxinas y cuando se usa un método de análisis confiable el primer factor que llega a tener una influencia directa en el resultado es el muestreo. El problema del muestreo, en el caso de micotoxinas, es un problema bastante fuerte y representa la mayor fuente de error en los resultados. Se ha mostrado que el error total del análisis se distribuye como sigue: alrededor del 88% en el muestreo, de un 5% al 10% en el submuestreo y de un 2% al 5% en el análisis químico (Whitaker et al 1974). En este aspecto hay consenso respecto a que un mal procedimiento de muestreo lleva a resultados que difieren de un laboratorio a otro. Por lo tanto, se recomienda seguir un procedimiento de muestreo establecido y que el tamaño de muestra para el análisis en granos no sea inferior a 5 kg (NOM-188-SSA1-2000). El envío de la muestra al laboratorio debe hacerse en bolsa de papel Kraft para el caso de granos y alimentos.
Es importante mencionar que aunque el análisis en sí representa un porcentaje bajo del error total cometido en la determinación, el uso de un método no adecuado puede cambiar esto. Es decir, la utilización de un método que no es confiable puede llevar a que el error del análisis supere completamente el error del muestreo, ya que los valores obtenidos pueden ser completamente erróneos. Por consiguiente la utilización de un método confiable es fundamental.
Una vez que la muestra llega al laboratorio ésta pasa por un proceso de preparación  que consiste en molienda y cuarteo para obtener una submuestra pequeña pero representativa que es analizada. Es importante mencionar que se debe moler toda la muestra en un molino especialmente diseñado para este propósito.
Una vez molida la muestra en el laboratorio se utilizan 50 g para llevar acabo el análisis que en términos generales consiste en los siguientes pasos:
  1. Pesado de la muestra.
  2. Extracción con solventes.
  3. Limpieza o purificación del extracto.
  4. Detección y cuantificación.
  5. Interpretación de las mediciones.
Una vez pesada la muestra se lleva a cabo un proceso de extracción mediante el uso de solventes orgánicos o mezclas de ellos con agua. La eficiencia de la extracción de las micotoxinas va a depender del tipo de solvente utilizado. Los métodos instrumentales usan normalmente una mezcla de acetonitrilo con agua, mientras que los métodos rápidos utilizan metanol-agua lo que puede llevar a diferencias en la cantidad de micotoxinas extraídas. La selección del solvente a utilizar es un compromiso entre eficiencia del solvente por sus propiedades químicas y compatibilidad con el sistema analítico a utilizar. Esto es muy importante considerarlo ya que algunos solventes o condiciones de extracción como pH pueden afectar la detección final.
Posterior a esto, en algunos métodos se lleva realiza un proceso de limpieza o purificación para eliminar las impurezas tales como lípidos, carbohidratos, pigmentos, aditivos que pueden interferir con la cuantificación. Esto se lleva a cabo con el fin de aislar la micotoxina y evitar falsas señales en la detección final. Sin embargo algunos métodos como el ELISA no utilizan una etapa de limpieza. La limpieza puede ser llevada a cabo mediante purificación en fase sólida (SPE), para lo cual se utilizan ya sea columnas de inmunoafinidad o  mezcla de materiales como sílica que adsorben la micotoxina o las impurezas.
El paso final de la manipulación es la evaluación de la presencia o no de la micotoxina en la muestra. Para la detección o cuantificación existen diferentes métodos que pueden clasificarse en métodos de referencia y métodos rápidos. Los métodos de referencia son utilizados para la confirmación de resultados y son métodos normalmente instrumentales que son confiables por sus características. El método de cromatografía de líquidos (HPLC) es un método exacto y preciso que ha sido aceptado como método oficial (AOAC International 994.08) y como método de referencia para otras micotoxinas. Otros métodos de referencia son la Cromatografía de Gases (GC), que se utiliza para el análisis de Tricotecenos y la Cromatografía de Capa Fina (TLC). Sin embargo estos métodos no son, ampliamente utilizados, pues requieren de instrumentación de elevado costo y de una alta capacitación del usuario.
Por consiguiente en los últimos años se han desarrollado los métodos rápidos que en su mayoría son  inmunoquímicos para facilitar el análisis. La ventaja de estos métodos es que son rápidos, simples y de bajos requerimientos instrumentales. Por consiguiente, en el caso de un gran número de análisis a realizar, los métodos inmunoquímicos representan una buena alternativa. Sin embargo, su mayor desventaja es que se presentan interferencias que ocasionan falsos positivos que conllevan a una interpretación problemática. Por lo tanto, los valores positivos obtenidos con estos métodos es conveniente que sean confirmados mediante un método de referencia.
Los métodos inmunoquímicos comerciales se pueden dividir básicamente en métodos que utilizan columna de inmunoafinidad y métodos ELISA. Aunque el método de columna de inmunoafinidad fue originalmente desarrollado para la cuantificación mediante Fluorometría, en la actualidad las columnas han sido utilizadas para la purificación y concentración de las micotoxinas para su detección posterior mediante HPLC, GC y TLC. Los métodos ELISA son generalmente utilizados como monitoreo rápido. Otro aspecto importante es que el método analítico utilizado por el laboratorio haya sido desarrollado y validado para el tipo de insumo analizado.
La parte final tiene que ver con el recurso humano ya que la interpretación de la señal sea cual sea el método depende del analista, por lo que es muy importante contar con personal calificado que sepa discernir las señales de lo que se conoce como ruido.
Es importante que el método seleccionado por un laboratorio sea validado en sus instalaciones y para esto se pueden comparar los resultados contra los de un método de referencia. Así la confiabilidad del método analítico se asegura. La validación del método debe incluir entre otros parámetros la exactitud y la precisión.
 
Validación del método analítico.
La validación del método analítico es una actividad debidamente documentada que permite demostrar que un método de análisis cumple con el propósito para el que fue desarrollado. Su objetivo es separar la variación debida al procedimiento analítico de la variación debida a la muestra. De esta manera se tiene la certeza de que el valor obtenido es confiable. La validación consiste en determinar su exactitud y su variabilidad. Para llevar a cabo la validación, en términos generales se requiere evaluar:
  1. Exactitud. Nivel de concordancia entre el valor verdadero o aceptado y el valor observado o medido por el método.
  2. Precisión. Grado de concordancia entre una serie de mediciones repetidas de una muestra homogénea.
  3. Especificidad. Capacidad de detectar sin equivocación la micotoxina de interés en la presencia de otros componentes que pueden estar incluidos normalmente.
  4. Linearidad. Capacidad de un procedimiento analítico para obtener resultados que son directamente proporcionales a la concentración de la micotoxina.
  5. Rango. Intervalo entre el límite superior e inferior de concentraciones de la micotoxina en la muestra para el cual se ha demostrado que el procedimiento es el adecuado.
  6. Límite de detección. La mínima cantidad de un analito en una muestra que puede ser detectado, pero no necesariamente cuantificado como un valor exacto.
  7. Límite de cuantificación. Cantidad mínima de la micotoxina en una muestra que puede ser cuantificada con exactitud y precisión.
  8. Robustez o Tolerancia. Capacidad de un método para no ser afectado por pequeñas variaciones que pueden ocurrir durante su ejecución.
  9. Adecuabilidad del sistema. Capacidad del sistema para detectar el analito analizado.
 
Exactitud y precisión de un método.
La evaluación de la confiabilidad de un método analítico esta basada fundamentalmente en la determinación de su exactitud y su precisión. La exactitud de un método se  define como el nivel de concordancia entre el valor verdadero o aceptado y el valor observado o medido por el método en cuestión. Con frecuencia la exactitud se reporta como recobre o como "BIAS". El recobre no es otra cosa que el valor en porcentaje de la división del valor medido entre el valor verdadero. "BIAS" es la diferencia entre el valor medido y el valor verdadero. La exactitud nos indica que tan lejos está el valor medido del valor verdadero y está relacionada con el error sistemático de la medición. Por otra parte la precisión de un método puede ser definida como el grado de concordancia entre una serie de mediciones repetidas de una muestra homogénea y normalmente se expresa con la desviación estándar relativa o coeficiente de variación. La precisión está relacionada con el error aleatorio de la medición y se puede estimar mediante el coeficiente de variación calculado con la ecuación de Horwitz (1982):
CV (%)  = 2 C(-0.1505)
donde la concentración C se expresa como potencias de 10, (ejemplo1 ppm = 10-6). Para concentraciones del orden 1 ppm es del 16% y para concentraciones de 10 ppb es del 32%.
El valor medido por un método (y) puede ser representado por la siguiente expresión:
y = Yreal  + error sistemático  + error aleatorio
donde Yreal  es el valor verdadero o aceptado. Como puede observarse en esta expresión, ambos tipos de errores o dicho en otras palabras, la exactitud y la precisión afectan directamente el valor determinado por el método en cuestión. Por consiguiente para que un método sea confiable se requiere que ambos errores estén bajo control y distribuidos alrededor del valor real.
Existen varios criterios para evaluar la exactitud y la precisión de un método analítico. Una manera fácil de evaluar la exactitud es mediante la estimación del intervalo de confianza de la media del método evaluado. Para que el método sea considerado exacto, el valor verdadero, en este caso el valor obtenido por el método HPLC, debe estar dentro del intervalo de confianza calculado. El intervalo al 95% de confianza se determina mediante una distribución t de Student. Para estimar la precisión, se calcula el coeficiente de variación con el valor medio de cada método mediante la ecuación de Horwitz y se compara con el coeficiente de variación experimental. Este último debe estar entre 2/3 y 1 del valor calculado con la ecuación de Horwitz.
 
Conclusión.
El análisis de micotoxinas es una actividad compleja que inicia desde la toma de la muestra y termina en el valor reportado por el laboratorio. La selección del método de análisis  implica considerar el tipo de muestra y la micotoxina a analizar. El método seleccionado debe ser validado para garantizar resultados confiables y que puedan ser utilizados para cualquier actividad, ya sea legal o de control de calidad.
 
Referencias.
  1. Horwitz, W. 1982. “Evaluation of Analytical Methods Used for Regulation of Foods and Drugs”. Analytical Chemistry 54, 67A.
  2. Lara, J., J. Muñoz y J.C. Medina. 2000 “Evaluación de Métodos Analíticos para la Determinación de Aflatoxinas”. ANECA 2000.
  3. NOM-188-SSA1-2000,  Norma Oficial Mexicana. Control de Aflatoxinas en cereales para consumo humano y animal
  4. Whitaker, T.B., J.W. Dieckens y R.J. Monroe. 1974. Variability of Aflatoxin Test Results. J. Am. Oil Chem. Soc. 49, 590.
Temas relacionados
Autores:
Javier Lara
IASA
Seguir
Únete para poder comentar.
Una vez que te unas a Engormix, podrás participar en todos los contenidos y foros.
* Dato obligatorio
¿Quieres comentar sobre otro tema? Crea una nueva publicación para dialogar con expertos de la comunidad.
Crear una publicación
Súmate a Engormix y forma parte de la red social agropecuaria más grande del mundo.
Iniciar sesiónRegistrate