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Autor: Dra. Eva Maria Binder, Directora Científica Romer Labs
LC/MS/MS - El nuevo
método de referencia
para la detección de
micotoxinas?
Requisitos de las técnicas modernas de
análisis de micotoxinas
Las micotoxinas más importantes son: aflatoxinas,
tricotecenos, zearalenona y sus derivados, fumonisinas,
ocratoxinas, alcaloides del ergot y patulina.1.
Varias
micotoxinas pueden ocurrir en forma simultánea, dependiendo de las condiciones ambientales y el tipo de sustrato.
Considerando esta coincidencia en la producción, es más
acertado decir que tanto los humanos como los animales están
más expuestos a mezclas de micotoxinas que a estos
compuestos en forma individual. Recientemente se han
reportado ocurrencias naturales de micotoxinas
enmascaradas, donde las toxinas se encuentran formando
conjugados, requiriéndose principios de detección cada vez
más sensibles y más selectivos.1,2,3
La mayoría de los métodos analíticos detectan una sola
micotoxina o una clase de micotoxinas, y por lo tanto,
incluyen solamente un número limitado de analitos
químicamente relacionados. Pero como se han observado
efectos aditivos y sinérgicos, concernientes a la peligrosidad
para la salud que poseen las micotoxinas, se han
incrementado los esfuerzos para desarrollar métodos para
multitoxinas, para un screening en simultáneo de diferentes
clases de micotoxinas. La cromatografía líquida de alto
desempeño (HPLC) y la cromatografía gaseosa (GC) son
tradicionalmente los sistemas de elección de los analistas
cuando se requieren resultados sensibles, confiables y con
una variabilidad mínima. La mayor desventaja del análisis de
micotoxinas a través de GC, es la necesidad de derivatización,
que insume mayor tiempo de análisis y puede inducir a un
mayor error, por esto, los métodos de GC se utilizan cada vez
con menor frecuencia. El HPLC puede acoplarse a una
variedad de detectores, esto es, detectores
espectrofotemétricos (UV-Vis, arreglo de diodos),
refractómetros (RI), detectores de fluorescencia (FLD),
detectores electroquímicos, detectores de radioactividad y
espectrómetros de masas.
Particularmente la combinación de
la cromatografía líquida (LC) y la espectrometría de masas
(MS), provee un gran potencial para el análisis de
micotoxinas, debido a que no es necesaria la derivatización
pre o postcolumna de la muestra. Por esto, ninguna otra
técnica en el área analítica instrumental para toxinas
ambientales, se ha desarrollado tan rápidamente en los
últimos 10 años.
Cromatografía Líquida
La tecnología de la cromatografía líquida – espectrometría de
masas (LC/MS) abre una nueva perspectiva para los análisis
espectrométricos eficientes en laboratorios de rutina, para la gran
mayoría de las muestras. Esta técnica, que en muchos casos
utiliza detectores espectrométricos multi-masas, puede ser
utilizada potencialmente, para medir un amplio de rango de
analitos, sin limitaciones de masa molecular, con una
preparación de la muestra en forma simple, sin necesidad de una
derivatización química, y debido a la robustez de los
instrumentos, un mantenimiento limitado.
Así, la cromatografía
líquida/espectrometría de masas (LC/MS), y particularmente la
LC acoplada a espectrómetros de masa en tándem (LC/MS/MS),
se volvieron muy populares en el análisis de micotoxinas.
Recientemente, se ha descrito y validado un método de
cromatografía líquida/espectrometría de masas en tándem para
39 micotoxinas en trigo y maíz; los analitos determinados
fueron: tricotecenos de grupo A y B y sus metabolitos,
zearalenona y sus derivados, fumonisinas, eniantinas, alcaloides
del ergot, ocratoxinas, aflatoxinas y moniliformina.1
El desarrollo de métodos LC/MS para la determinación de
micotoxinas, tiene determinadas limitaciones, por la diversidad
química de los analitos, y la complejidad de las condiciones para
la preparación de las muestras.1
Considerando el amplio rango de
polaridades de los analitos que pueden someterse a una detección
tan sensible como la del MS/MS, puede percibirse erróneamente
que las interferencias de las matrices pueden eliminarse
efectivamente y se pueden obtener resultados cuantitativos con
poca o ninguna limpieza de la muestra y una pequeña separación
cromatográfica. Desafortunadamente, los componentes propios
de la matriz presentes en el extracto, pueden influir en la
eficiencia de la ionización del analito en forma positiva o
negativa, perjudicando la repetibilidad y exactitud de la técnica
analítica.1
Como consecuencia, solo unos pocos abordajes
describen una inyección exitosa de extractos crudos, y la mayoría
de las publicaciones describen una limpieza o purificación de la
muestra, previa a la inyección al cromatógrafo líquido, con
extracción en fase sólida (SPE) como el procedimiento más
eficiente, y en particular la utilización de columnas Mycosep® como la manera más directa y eficaz.4,5,6,7,8,9
Análisis de Dilución de Isótopos Estables
(Stable Isotope Dilution Assay – SIDA)
Para minimizar los efectos de las matrices y sus problemas
relacionados con la cuantificación, la recomendación es calibrar
con matrices externas para cada producto a ser analizado, pero
esto insume demasiado tiempo, y está probado de que no es muy
práctico en las condiciones de rutina, donde se confronta con
varias matrices cada día. Como una alternativa, se ha introducido
recientemente la utilización de patrones internos marcados con
isótopos [estables].10
Estas sustancias no están presentes en las
muestras en forma natural, pero tienen propiedades idénticas a
las de los analitos. Los patrones internos son sustancias muy
similares a los analitos buscados, es decir, su estructura
molecular debe ser lo más parecida posible al analito en cuestión,
mientras que el peso molecular debe ser diferente. Durante el
proceso analítico, el patrón se adiciona tanto a la solución
calibrante como a las muestras analíticas, y por comparación del
ratio del área bajo la curva del patrón interno y del analito, puede
determinarse la concentración del analito.
El patrón interno ideal es una molécula del propio analito
marcada con un isótopo, que normalmente se prepara por síntesis
orgánica intercambiando algunos átomos de hidrógeno por
deuterio, o reemplazando átomos de carbono [12C] por átomos de
carbono [13C]. Las propiedades fisicoquímicas de estas
sustancias, y especialmente, los potenciales de ionización son
muy parecidas o están muy cerca de las del analito que ocurre en
forma natural, pero es posible la distinción entre el analito y el
patrón interno por el peso molecular más elevado (debido a la
incorporación de isótopos). Las variaciones que ocurren durante
la preparación de la muestra y la purificación de los extractos, así
como aquellas durante la ionización, se ven compensadas en
aquellos métodos analíticos que pueden desarrollarse con gran
exactitud y precisión. Lo óptimo, es que aquellos análogos
marcados con isótopos posean una masa molecular lo
suficientemente grande para anular los efectos de la abundancia
natural de isótopos pesados en el analito. Esta diferencia de masa
dependerá, generalmente, del peso molecular del analito; en el
caso de moléculas con un peso molecular entre 200 y 500, se
requiere un mínimo de masa tres veces mayor.
Los patrones marcados con isótopos provistos por Biopure, están
completamente marcados, suministrando así una diferencia de
masas óptimas entre el patrón marcado y el analito blanco. Por
ejemplo, el patrón [13C15]-DON disponible como calibrante
líquido (25mgl-1) fue caracterizado de manera minuciosa por
Häubl et al.9 con respecto a la pureza, la distribución y
sustitución del isótopo, siendo esta última, cercana al 99%.
Experimentos de fortificación con maíz, prueban que la
utilización de [13C15]-DON como patrón interno es apropiada,
indicando un coeficiente de correlación (R2) de 0,9977 y una tasa
de recuperación de 101% +/- 2.4%. El mismo análisis sin
considerar el patrón interno, resultó con un R2=0.9974 y una tasa
de recuperación de 76% +/- 1.9%, resaltando con éxito, la
compensación de las pérdidas debidas a la preparación de la
muestra y a los efectos de supresión iónica por patrones internos
marcados con isótopos.
Conclusiones
El acoplamiento directo entre una técnica de separación en fase
líquida como la cromatografía líquida y la espectrometría de
masa, ha sido reconocido como una poderosa herramienta para
análisis de mezclas de gran complejidad. Las principales
ventajas incluyen bajos límites de detección, la posibilidad de
generar información estructural, los requerimientos mínimos de
preparación de las muestras y la posibilidad de cubrir un amplio
rango de analitos de polaridades diferentes. Dependiendo de la
interfase técnica aplicada, un gran número de compuestos
orgánicos pueden ser detectados y pueden manejarse flujos de
hasta 1,5 ml/min. A pesar de su alta sensibilidad y selectividad,
los instrumentos LC/MS/MS se ven limitados, debido
diferencias inducidas por las matrices, en la eficiencia de la
ionización y la intensidad de la señal entre los calibrantes y los
analitos, la supresión/realce de los iones debido a los
componentes de las matrices, que ingresan al espectrómetro de
masas conjuntamente con los analitos, limitan incluso la robustez
y exactitud y son fuentes potenciales de errores sistemáticos.
Los patrones internos marcados con isótopos estables,
suministran un solución a estos problemas, así como también
compensan las fluctuaciones debido a la preparación de la
muestra, es decir en la extracción y la limpieza. Numerosos
métodos de LC/MS/MS para la determinación de micotoxinas se
han desarrollado y publicado en estos últimos años, sin embargo,
solamente hay unos pocos basados en analitos marcados con
isótopos estables, principalmente debido a su limitada
disponibilidad y calidad. Sólo recientemente, se han introducido
micotoxinas marcadas completamente con [13C], abriendo así un
amplio campo de aplicaciones y mejoras en el análisis de
micotoxinas. Por lo tanto, el desarrollo en particular de métodos
unificados multi-toxinas apropiados para la determinación de
varias combinaciones analitos/matrices, se vuelve un desafío
para el futuro.
References
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Schuhmacher, R. 2006. Development and
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4
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- Häubl, G., Berthiller, F., Rechthaler, J.,
Jaunecker, G., Binder, E.M., Krska, R.,
Schuhmacher, R. 2006. Characterisation
and application of isotope-substituted
(13C15)-deoxynivalenol (DON) as an
internal standard for the determination of
DON. Food Add. Contam. In print.
- Sakairi, M., Kato, Y. 1998. Multiatmospheric
pressure ionization interface
for liquid chromatography-mass
spectrometry. J. Chromatography A, 794,
391-406.
Autor: Dra. Eva Maria Binder, Directora Científica Romer Labs
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 DISCUSIONES SOBRE ESTE TEMA.
 
| 12/01/2007 |
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Jaime Borrell
Veterinario/biovet,s.a. Laboratorios
Cataluna - España |
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Es importante resaltar el hecho de que la mayoria de las micotoxinas que afectan a aves y porcino pueden clasificarse en 4 grupos de estructuras bioquimicas. Ademas de los estudios sobre sinergismo entre diferentes micotoxinas hay que tener en cuenta la suma de cantidades de micotoxinas, del mismo grupo, presentes en un alimento. Con ello se puede entender que materias con analisis negativos pueden ocasionar problemas. Por tanto se hace necesaria, junto a la mejora de los metodos analiticos, una mejora en la capacitacion que quienes deben interpretar los analisis en lo referente a los grupos bioquimicos mas importantes. | Respuesta Chequeada por Engormix.com  |
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| 14/01/2007 |
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Creo que el problema radica en conseguir patrones marcados totalmente para todas las micotoxinas estudiadas, y el hecho de que deban incluirse en el ensayo cada una de ellas para hacer análisis multitoxinas. Sería interesante conocer el costo y la precisión del método. | | Respuesta Chequeada por Engormix.com |
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| 15/01/2007 |
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Existe un método inmunológico para medir micotoxinas que es el elisa como está descrito en esta página http://www.fao.org/docrep/field/003/AB482S/AB482S15.htm, y en cuanto a la marcación no es tan difícil, es una reacción yodo tirosina purificado por resinas de intercambio iónico. | | Respuesta Chequeada por Engormix.com |
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| 28/03/2007 |
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Maria Antonia Rodríguez Martínez
Qfb/indukern De México
Jalisco - México |
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Ma. Antonia Rodríguez
Gerente de Control de Calidad.
Me gustaría saber qué método rápido de análisis me recomiendan para determinar Mixotoxinas en el alimento para pollos. | | Respuesta Chequeada por Engormix.com |
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| 30/03/2007 |
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Belisario Acevedo
Gerente/asinal Ltda
Cundinamarca - Colombia |
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Nosotros conocemos y usamos columnas de inmunoafinidad aflatest, ochratest zearalates, etc
Cualquier informacion adicional con gusto la podemos ampliar
Belisario Acevedo |
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| 09/06/2007 |
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Juan Ruffino
Director General - Inbox Technology And Services S.a./inbox Technology And Services S.a.
San Jose - Costa Rica |
| INBOX Technology and Services S.A. - Tel: (506) 291-0089 - Fax: (506) 290-6518 |
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| 11/06/2007 |
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Les adjunto un información recientemente publicado en la última reunión de la IUPAC en Estambul. Muestra la capacidad de una nueva columna de inmunoafinidad multiresíduos de micotoxinas para la purificación previa a un análisis por LC/MS-MS.
Saludos,
Dan Kaplan R-Biopharm Latinoamérica
Nota de la Redacción:
El material enviado esta publicado en idioma INGLÉS. Hecha esa aclaración, Para ver la información: CLICK AQUI
Saludos
Hugo Gargaglione
Engormix.vom | | Respuesta Chequeada por Engormix.com |
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| 10/09/2007 |
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Estimada:
Estoy interesado en este método multitoxinas. Pero mi pregunta es: si el método incluye la detección de Patulina, ya que no la encontré en las tablas mostradas abajo. Si usted puede proveerme información acerca de la detección de esta micotoxina le agradeceré muchísimo. Saludos cordiales.
Lic. Matías Baldo | | Respuesta Chequeada por Engormix.com |
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| 13/12/2007 |
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Estimado Carlos Bautista:
Trabajo en un Laboratorio en Argentina donde realizamos el análisis de micotoxinas por LC-MS/MS utilizando estándar interno, y te comento que estamos obteniendo muy buenos resultados con recuperaciones entre el 90 y el 110 %, y con límites de detección acordes a las regulaciones europeas.
Saludos cordiales a todos
Lic. Matías Baldo | | Respuesta Chequeada por Engormix.com |
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| 03/03/2008 |
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Estimado Vivían María Fontalvo:
Aquí le envío un cuadro con algunos datos sobre el método multitoxinas (LC-MS/MS) desarollado en nuestro laboratorio. Espero le sea de utilidad. Saludos.
 | | Respuesta Chequeada por Engormix.com |
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