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Expresión de la ß-defensina 10 de neutrófilo bovino (bnb10) en la glándula mamaria bovina con mastitis crónica

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Resumen

La mastitis es la enfermedad que más afecta al ganado lechero en todo el mundo y se caracteriza por la inflamación de la glándula mamaria. Los péptidos antimicrobianos juegan un papel importante en los mecanismos de defensa innata en la glándula mamaria contra microorganismos causantes de mastitis. En el presente estudio se determinó la expresión de la β-defensina BNBD10 en 5 regiones de la glándula mamaria bovina con mastitis mediante qPCR y se detectaron copias de mRNA en nódulo linfático, parénquima, canal del pezón, cisterna y roseta de furstenberg. La expresión más alta se observó en el nódulo linfático (1.78 x 107 ) y la menor en la rosetta de furstenberg (7.11 x 105 ). Por tanto BNBD10 pudiera estar involucrado en la defensa local de la glándula mamaria.

Introducción

La mastitis es la enfermedad infecciosa más costosa de la industria lechera y Staphylococcus aureus es uno de los agentes causales más comunes. A fin de prevenir y tratar esta enfermedad es importante entender la función inmune en la glándula mamaria y la inmunidad innata; específicamente los péptidos antimicrobianos son uno de sus principales componentes (Ganz, 2003; Swanson et al., 2004) y su expresión varía de acuerdo al patógeno involucrado (Alva-Murillo et al., 2013). En bovinos solo se han descrito a las β-defensinas e incluyen a: péptido antimicrobiano lingual (LAP), defensina entérica bovina (EBD), defensina de neutrófilo bovino (BNBD) y al péptido antimicrobiano traqueal (TAP), cuya expresión es variable en células epiteliales siendo muy alta en tejidos que están constantemente expuestos y colonizados por microorganismos (Swanson et al., 2004), además de que pueden expresarse de manera constitutiva o inducida (Yang et al., 2004). Las defensinas como BNBD4, BNBD10 y DEFB1, se expresan de manera constitutiva en la glándula mamaria bovina sana (Tetens et al., 2010; Goldammer et al., 2004), pero también han mostrado ser inducibles en respuesta a Escherichia coli en cultivos de células epiteliales mamarias de bovino (bMEC) y también in vivo (Gunter et al., 2009). Otro estudio mostró que bMEC tuvieron una expresión basal de TAP, LAP, BNBD5, BNBD10, BNBD4 and DEFB1, y además todos fueron inducibles por S. aureus in vitro con altos niveles de expresión (Alba-Murillo et al., 2013). Por lo anterior, la expresión constitutiva e inducible de β-defensinas en la glándula mamaria sana y con mastitis ha mostrado la importancia de estos péptidos antimicrobianos en la respuesta innata inmediata a patógenos invasores. El objetivo de este estudio fue determinar el nivel de expresión de la β- defensina BNBD10 en diferentes regiones de la glándula mamaria bovina con mastitis crónica por S. aureus.

 

Materiales y métodos

Se colectaron muestras de tejido mamario (cisterna, parénquima, rosetta de fuerstenberg, esfínter y nódulo linfático inguinal) de vacas con mastitis, después del sacrificio. Las muestras se, colocaron en RNAlater y fueron mantenidas a -20 C hasta la extracción de RNA. Posteriormente los tejidos fueron congelados con nitrógeno líquido, pulverizado y el RNA extraído con el kit RNeasy Mini Kit siguiendo el protocolo del fabricante. El RNA fue cuantificado por espectrofotometría y su calidad comprobada por electroforesis en agarosa al 1%. A partir del RNA se preparó cDNA, mediante transcripción reversa utilizando 250 ng de cada RNA total y 200 U de transcriptasa reversa (Superscript III, Invitrogen), siguiendo las instrucciones del fabricante. Se utilizó el primer (Gen: BNBD10; Primer 5´a 3´: F: AGTTATCTAAGCTGCTGGG; R: CGCTCTGTCAAAGGGTC). Para el qPCR se utilizó el kit Quantitect Platinum SYBR Green (Quiagen) de acuerdo a las condiciones descritas por Tetens et al. (2010). Se construyó una curva estándar cuantificada y diluida del producto de PCR y controles negativos. Las cantidades del mRNA específico de cada región fueron medidas mediante la curva estándar. El mRNA de GAPDH fue usado como un control interno invariante para normalizar la expresión de los genes. El número de copias del péptido específico expresan en cantidad de mRNA/106 copias del gen GAPDH.

 

Resultados y discusión

El límite de detección para el qPCR fue de 100 copias de mRNA según la última dilución de la curva estándar (1x102 ). Las curvas de fusión no mostraron productos inespecíficos de qPCR, indicando especificidad de los primers. El gen GADPH en su valor Ct estuvo por debajo de los ≤ 0.5 ciclos en sus medidas repetidas considerándose estable. La expresión de BNB10 se encontró en todas las regiones de la glándula mamaria en diferentes niveles, como se muestran en la figura 1. El mayor número de copias de mRNA fue en nódulo linfático inguinal (1.78 x 107 ), seguido por el parénquima (5.13 x 106 ), canal del pezón (2.8 x 106 ), cisterna (1.36 x 106 ), y el menor nivel fue detectado en la rosetta of furstenberg (7.11 x 105 ). Estos resultados coinciden con los de Tetens et al (2010) y Goldammer et al (2004) quienes reportaron la expresión constitutiva de este péptido antimicrobiano en la glándula mamaria bovina y que ha sido relacionado con la expresión de β- defensinas en neutrófilos que residen ahí (Tetens et al., 2010; Goldammer et al., 2004); por lo que de acuerdo a los resultados de este estudio estos péptidos también pudieran ser inducibles en presencia de S. aureus debido a la alta afluencia de neutrófilos durante la inflamación crónica. Además, estos resultados son similares a los publicados por Gunther et al (2009) en donde estos péptidos fueron inducibles en la glándula mamaria con mastitis causada por E. coli, y por tanto actúan contra patógenos invasores.

 

Conclusiones

El presente estudio mostró por primera vez el patrón y nivel de expresión del péptido antimicrobiano BNBD10 en diferentes regiones de la glándula mamaria con mastitis clínica crónica por S. aureus, observándose la mayor expresión en el nódulo linfático. Además, se detectó en la rosetta de furstenberg y parénquima donde se especula que pudiera ser inducible puesto que no ha sido reportada su expresión en la glándula mamaria sana; y se especula también que pudiera ser constitutiva e inducible en cisterna y canal del pezón ya que en este estudio se detectó su expresión ya que existen reportes de su expresión en la glándula mamaria sana como en la enferma.

 

Literatura citada

Alva-Murillo, N., A. Ochoa-Zarzosa, J.E. López-Meza. 2013. Effects of sodium octanoateoninnate immune response of mammary epithelial cells during Staphylococcusaureus internalization. Biomed. Res. Int., 2013: 927643. BioMed. Res. Int. Article ID 927643, 8.

Ganz, T. 2003. Defensins: Antimicrobial peptides of innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 3:710– 720.

Goldammer T., H. Zerbe, A. Molenaar, H.J. Schuberth, R. M. Brunner, S. R. Kata and H. M. Seyfert. 2004. Mastitis increases mammary mRNA abundance of beta-defensin 5, toll-likereceptor 2 (TLR2), and TLR4 but not TLR9 in cattle. Clin. Diagn. Lab. Immunol.174-85.

Günther, J., D. Koczan, W. Yang, G. Nürnberg, D. Repsilber, H.J. Schuberth, Z. Park, N. Maqbool, A. Molenaar, H.M. Seyfert,. 2009. Assessment of the immune capacity of mammary epithelial cells: comparison with mammary tissue after challenge with Escherichia coli. Vet. Res., 40(4), 31.

Swanson, K., S. Gorodetsky, L. Good, S. Davis, D. Musgrave, K. Stelwagen, V. Farr, and A.Molenaar. 2004. Expression of a beta-defensin mRNA, lingual antimicrobial peptide, inbovine mammary epithelial tissue is induced by mastitis. Infect. Immun. 72:7311–7314.

Tetens, J., J. J Friedrich, A. Hartmann, M. Schwerin, E. Kalm, y G. Thaller. 2010. The spatial expression pattern of antimicrobial peptides across the healthy bovine udder. Dairy Sci. J. 93:775-783.

Yang, D., A. Biragyn, D.M. Hoover, J. Lubkowski, J.J. Oppenheim. 2004. Multiple roles of antimicrobial defensins, cathelicidins, and eosinophil-derived neurotoxin.

 

Figura 1. Nivel de mRNA de la β-defensin BNBD10 en 5 regiones de la glándula mamaria bovina con mastitis por S. aureus. El número de copias de mRNA esta is normalizado con la expresion del gen GAPDH bovino. BNBD10 (bovine neutrophil β-defensin-10); DEFB1 (β-defensin-1).

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