Composición química del extracto de Melinis minutiflora y su efecto repelente e ixodicida hacia larvas de Amblyomma cajennense

En las zonas tropicales y subtropicales a nivel mundial, el principal problema zoosanitario son las garrapatas y las enfermedades que transmiten. Afectan el 80 % del ganado mundial, y son los segundos vectores de enfermedades en animales silvestres, domésticos y humanos, solo después que los mosquitos. En especial, la garrapata Amblyomma cajennense, se caracteriza por generar deterioro en el ganado, infestaciones, detrimento de la piel, pérdida de peso, bajo rendimiento productivo y hasta la muerte. Se estima que las garrapatas han generado pérdidas a nivel mundial de 13-18 billones de dólares, en Latinoamérica de un billón de dólares y en México de 48 millones de dólares. A. cajennense es de distribución mundial. Así mismo, es considerada la segunda de importancia económica. En México se le ha reportado en zonas tropical, templada y árida, y se distribuye en 609,857 Km2, alrededor del 31% del área nacional (Estrada et al., 2009).

El principal método de control de estos ácaros, es la aplicación de químicos sintéticos (QS). Sin embargo, el uso frecuente e indiscriminado de este tipo de plaguicidas ha favorecido el desarrollo de cepas de garrapatas resistentes a éstos, además de impactar negativamente al ambiente y de residuos químicos en los alimentos de origen animal. 

Una alternativa para disminuir el uso de QS, son lo bio-garrapaticidas de origen botánico, productos naturales generados del metabolismo secundario de las plantas. Los cuales podrían favorecer el desarrollo de programas en control integrado de garrapatas. Dichos programas incluyen el manejo de razas resistentes, manejo nutricional, rotación de parcelas, quema controlada, hongos entomopatógenos, vacunación y bio-garrapaticidas (Abbas et al., 2014)

Melinis minutiflora de la familia poaceae, caracterizada por secretar una oleorresina por sus tricomas de hojas y tallos. Esta oleorresina presenta efecto repelente contra garrapantas que se ha demostrado en dicha planta. (Muro et al., 2004). No obstante, su extracción ha dificultado la identificación química de los compuestos que podrían ser los responsables de dicha actividad.

El objetivo de esta investigación fue identificar los compuestos químicos de los extractos de tallo y hoja de M. minutiflora y evaluar el efecto repelente e ixodicida de los extractos sobre larvas de garrapata del género Amblyomma cajennense. 

 

Localización y descripción de material biológico experimental: La semilla de M. minutiflora se obtuvo del Centro Nacional de Investigación Disciplinaria en Parasitología Veterinaria, Jiutepec, Morelos, Mex. Se sembró manualmente, en el municipio de Tepic, a 21°, 31' LN y 104°, 54' LO, altitud de 920 m, precipitación de 1121 mm, temperatura 15-25 °C, el clima trópico seco a subhúmedo, la mayor precipitación en el verano. Se estableció una parcela de 5 x 7 m compuesta de 15 surcos, la densidad de siembra fue de 12 kg/ha. Se manejó una fertilización básica (100-50-50 Kg de NPK/ha), a los 45 días posteriores a la siembra y otra a los 70 días, esta última solo 50 % del nitrógeno. Extracción en Soxhlet de Tallo y Hoja de M. minutiflora: Los extractos de Tallo y Hoja de M. minutiflora, se realizó en la Universidad Autónoma de Nayarit, a una edad fitofenológica de 90 días. Previo al proceso de extracción, se fragmentaron las muestras a partícula de 0.3- 0.5 cm y se pesaron 50 g de material vegetal, se inició la preparación del equipo Soxhlet (Kimax® de 250 mL). Para ello se colocó un papel filtro (Whatman No. 1) en extractor del equipo y se agregó la muestra correspondiente del pasto. Se vertieron 150 mL del solvente etanol a 96 % en el matraz del equipo y se procedió por reflujos constantes hasta agotamiento de la planta, este procedimiento fue a 60 – 70 °C. Terminada la extracción, se concentraron los extractos en roto-evaporador a presión reducida (ACME®) a una temperatura 40 – 50 °C y se obtuvo el rendimiento de extracto crudo. Este se resuspendió en 50 mL de etanol al 99.5 % y se colocaron en frascos ámbar para realizar el análisis fitoquímico en Cromatógrafo de Gases-Espectrómetro de Masas (CG-EM) y pruebas in vitro.

Cultivo de larvas A. cajennense: Las larvas de A. cajennense fueron capturadas manualmente de los vacunos, en la localidad de Jesús María Corte, Tepic, Nayarit, Méx. Se colocaron en hielera a 4 – 6 °C y trasladaron al Laboratorio de Resistencia y Taxonomía de Garrapata del Comité para el Fomento y Protección Pecuaria de Nayarit, para ser identificadas en microscopio estereoscópico (ZEISS®). Para la obtención de los huevecillos, se depositaron 10 garrapatas en una caja Petri e incubaron (Precisión Incubator®, modelo 6) a 27 ± 2 °C, con una humedad relativa (HR) de 80 – 90 %, por 14 días. Los huevecillos se colocaron en viales de 15 mL e introdujeron a la incubadora por 19 días a las mismas condiciones antes mencionadas hasta la eclosión. Las larvas se utilizaron a los 14 días post-eclosión, quedando así disponibles para los bioensayos: Prueba de olfactómetro (PO) y la Prueba de Inmersión de Larvas (PIL).

Identificación de compuesto químico por CG-EM: La identificación de los compuestos químicos de extractos de Tallo y Hoja fue en el Laboratório de Fitobioquímica, CINVESTAV Unidad Irapuato, Mex. Se utilizó un cromatógrafo de gases Agilent Technologies 7890ª con una columna capilar (J&W No. 122-0162DB-1ms), de 60 m, con diámetro externo 0.25 mm e interno 0.25 μm. Se empleó helio como gas acarreador. Temperatura de inyector fue de 250 °C. La temperatura inicial del horno fue de 150 °C por tres minutos, posteriormente se incrementó la temperatura a una velocidad de 4 ºC/min hasta llegar a 280 °C, lo que da un tiempo total de corrida de 60.5 min, con una presión de 24.942 psi.

Pruebas de Olfactómetro (PO): La repelencia se determinó en la Prueba de Olfactómetro, en un cristal tubular en forma de “Y”, de 9 cm de largo, 0.5 cm de diámetro interno y 0.8 cm de diámetro externo (Pírex®). Se impregnó una torunda de algodón con 1 mL del extracto crudo de Tallo, Hoja o etanol 99.5 % (control) con diez repeticiones cada tratamiento. Se desecaron a temperatura de laboratorio por 24 h y enseguida se colocó la torunda en un brazo del olfactómetro, en el otro brazo se ubicó otra torunda de algodón impregnada con etanol al 99.5%, y en la parte inferior del olfactómetro se colocó un lote de 1,000 larvas de A. cajennense. Se tapó con una torunda para evitar la salida de las larvas. Estas se dejaron ascender a través de las paredes por 20 min, después se cuantificaron las larvas que ascendieron en cada brazo, se utilizó un olfactómetro nuevo para cada ensayo. Se calculó el porcentaje de repelencia, con la siguiente fórmula de Muro et al. (2004):

Prueba de inmersión de larvas (PIL): Consistió en medir el efecto larvicida del extracto natural de Tallo, Hoja de M. minutiflora o etanol 99.5 % (control), con la técnica para productos naturales. Primero se colocó una hoja de papel Whatman No. 1 (8.5 x 7.5 cm) en una caja de Petri y sobre ella se introdujo un lote de 100 ± 10 larvas de 14 días de vida, enseguida se trató en forma homogénea con 5 mL del extracto a evaluar y se puso otro papel Whatman 1 (tipo emparedado), y se dejó inmerso por 5 minutos. Después se sacó el emparedado y plegó con broches para dejar evaporar el solvente por 40 min a temperatura ambiente. Se realizó el control respectivo utilizando etanol 99.5 % en lugar del extracto. Para cada tratamiento se realizaron diez repeticiones. Después cada paquete se identificó de acuerdo al tratamiento y colocó en incubadora por 24 h a 27 ± 2 °C y 80 – 90 % de HR. Se contaron las larvas vivas (con movimiento) y muertas (quietas o incapaces de movimiento). Con ello se calculó la mortalidad de acuerdo a la fórmula de Abbott (1925):

Análisis estadístico: Los datos obtenidos en porcentajes de las metodologías de PO y PIL fueron examinados en una prueba de normalidad de Kolmogorov-Smirnov. Al no presentar normalidad fueron transformados mediante la función de √(arcoseno x) y se analizaron en un diseño completamente al azar. Las diferencias entre las medias se determinaron mediante la prueba de Tukey (P<0.05), mediante el paquete estadístico SAS ver. 9.0.

 

Se identificaron 11 compuestos químicos en los extractos de tallo de M. Minutiflora. Los más abundantes fueron ácido 1,2-bencenedicaboxilico, mono (2-etilhexil) éster (33.42 %) y ácido hexadecanóico (6.96 %). En el extracto de hoja se identificaron 6 analitos, los de mayor porcentaje, ácido 1,2-bencenedicaboxilico, mono (2-etilhexil) éster (59.44 %) y heneicosano (3.19 %) (Tabla 1).

Muro et al. (2004), identificaron en M. minutiflora 12 compuestos químicos por CG-EM, observando la mayor abundancia relativa en Eicosano 18.53%, Acido linolénico metil ester 16.08% y ácido hexadecanóico 14.20%. Este último se encontró en esta investigación con el 6.96% del extracto de tallo. La causa probable de esta diferencia, puede radicar en las diferentes condiciones ambientales, y los diferentes procesos de extracción y análisis de la muestra.

Los componentes químicos reportados por Magano et al. (2008), en extractos de Senna italica en la subespecie Arachoides fue, ácido 2-benzenedicarboxílico, dibutyl ester al (2.32 %), acido 1,2 -benzenedicarboxílico, bis (2-etilhexil) éster al (20.19 %), ácido hexadecanóico al (51.55 %), ácido 9-hexadecanoico al (11.84 %), compuestos potencialmente responsables del efecto ixodicida en Hyalomma marginatum. Dos de ellos identificados en los extractos de M. minutiflora, el ácido 2-benzenedicarboxílico mono (2-etilhexil) y ácido hexadecanóico. En la presente investigación, los extractos de M. minutiflora mostraron repelencia y  mortalidad variable ante A. cajennense (Tabla 1). La repelencia de 75 % para tallo y 78 % en hoja, en cabio la mortalidad de 77 – 84 % para tallo y hoja, respectivamente (P < 0.05). Muro et al. (2004) demostraron una repelencia similar del extracto de M. minutiflora en tallo de 67 – 84 % y en hoja 50 – 80 %, contra Rhipicephalus (Bo.) microplus.

El estudio de Silva et al. (2011), con timol, lograron mortalidades de 18 – 94 %, en larvas de A. cajennense, mostrando mayor variabilidad en el efecto, respecto al extracto de M. minutiflora. Similarmente, Gomes et al. (2014), describen que con el aceite esencial de Lippia sidoides a una concentración de 9.40 mg/mL mueren 77.8 ± 38.4 larvas de A. cajennense resultados semejantes a extracto de M. minutiflora.

 

Existe la actividad repelente e ixodicida de M. minutiflora en contra de larvas A. cajennense, atribuyendo el efecto al sinergismo de los compuestos químicos. De los cuales se identificaron 11 y 6 analitos en tallo y hoja, respectivamente, en CG-EM. Es necesario continuar con la búsqueda del compuesto (s) con la actividad anti-garrapata.